文献追踪 |Circle-seq 等前沿技术！解析 eccDNA ANKRD28 驱动骨髓瘤耐药新机制

本文围绕多发性骨髓瘤（MM）展开研究，旨在探究 MM 对硼替佐米 - 来那度胺 - 地塞米松（VRd）治疗产生耐药性的机制，并明确非编码染色体外环状 DNA（eccDNA）区域作为增强子的作用。研究通过多种测序技术对血清 eccDNA 进行分析，取得了多项重要成果。

1.血清 eccDNA 的全基因组特征分析

实验流程与样本处理：研究人员收集了健康供体（HD）、对 VRd 治疗高敏感（HS）和低敏感（LS）的 NDMM 患者的血清样本，利用 Circle - seq 和 RNA - seq 技术进行全基因组分析。首先从血清中分离 eccDNA，采用原子力显微镜（AFM）可视化其环状结构，之后对其染色体起源、长度、circle score 及基因组分布等特征进行深入探究（图 1A - B）。

主要测序结果：经基因注释，共鉴定出 19218 个基因，6343 个 eccDNA 映射到基因区域，52.25% 的 eccDNA 与基因间区域重叠。在染色体分布上，chr1 的 eccDNA 平均数量最多。eccDNA 长度分布呈现 HD > HS > LS 的趋势，且多数长度在 100 - 1000bp。Circle score 评估显示，HD 组 eccDNA 比例较高，且随着 circle score 增加，eccDNA 比例先升后降。此外，eccDNA 在基因间区域、遗传区域和短散在元件（SINEs）中显著富集，尤其在 LS 组的基因间区域分布更多（图 1C - H）。

图 1：多发性骨髓瘤患者血清 eccDNA 的全基因组特征

A：研究设计中样本收集流程示意图。

B：MM 患者血清中提取的 eccDNA 的 AFM 图像。

C：HS 和 LS 样本中最常见基因组事件的堆积条形图，按细胞遗传学组分类。

D：相对于染色体的 eccDNA 频率，展示健康供体、高敏感和低敏感个体每染色体的 eccDNA 计数。

E：Circos 图显示 eccDNA 的染色体分布。

F：三组中 eccDNA 的长度分布，在 100 和 1000 碱基处有显著峰值。

G：HD、HS 和 LS 组中 eccDNA 的 Circle 分数。

H：HD、HS 和 LS 组中 eccDNA 的基因组分布。

2. VRd 治疗高敏感（HS ）和 低敏感（LS ）患者之间差异 eccDNA 和 eccGenes 分析

差异 eccDNA 筛选：以 log2FC > 2 且调整 p < 0.05 为阈值，初步筛选出 2484 个差异 eccDNA。其中，与 LS 患者相比，HS 患者中有 1803 个 eccDNA 上调，681 个下调。KEGG 富集分析表明，差异 eccGenes 主要富集在人类疾病（如癌症和抗肿瘤药物耐药性）和遗传信息处理（如复制、修复和转录）相关过程（图 2A - B）。

关键 eccDNA 确定：聚焦于 18 个高上调和 9 个低下调且 eccGenes 富集于癌症或骨髓瘤相关过程的 eccDNA，发现 LS 患者的这些 eccDNA 在染色体 3 上有更多脱落位置，而 HS 患者在染色体 1、5、11 和 19 上更为明显。通过进一步筛选和验证，确定 eccANKRD28 为关键研究对象，并通过多种实验证实其环状结构及在 MM 发病机制和 VRd 耐药中的作用（图 2C - G）。

图 2：HS 和 LS 患者之间差异 eccDNA 和 eccGenes

A：HS 和 LS 患者之间检测到的差异 eccDNA 的火山图，标记出上调和下调的 eccDNA。

B：NDMM

 患者中总差异 eccGenes 的 KEGG 通路分析。

C：显示所有差异 eccGenes 和 eccDNA 重叠的维恩图。

D：44 个高上调和 21 个低下调 eccDNA 的染色体分布。

E：10 个候选 eccDNA Circle - seq 队列及另 5 个

 HS 和 5 个 LS 样本的 qPCR 验证差异的条形图和分裂小提琴图。

F：在 RPMI8226、U266 和 OPM - 2 细胞中对 eccANKRD28 进行外向和内向 PCR 检测。

G：通过 FISH 检测 RPMI8226 细胞系中的 eccANKRD28，C4 - 2B 为阴性对照。

3.eccANKRD28 在 NDMM 患者预测和预后分层中的潜在作用

eccANKRD28 的来源及功能相关性：FISH 实验显示血清 eccANKRD28 主要来源于骨髓中的 CD138 + 浆细胞。对 LS 组中与高丰度 eccDNA 重叠的基因进行通路富集分析，发现其与经典同源重组（cHR）和非同源末端连接（NHEJ）通路相关，提示这些通路与 eccDNA 水平增加及肿瘤细胞中癌基因拷贝数扩增导致的化疗耐药有关（图 3A）。

eccANKRD28 与临床特征的相关性：通过 qPCR 对 eccANKRD28 进行拷贝数变异（CNV）定量，发现其与评估骨髓瘤肿瘤负荷的关键参数（如 FLCR (i/u)、BMPC%）呈正相关，与 ALB 呈负相关。此外，eccANKRD28 CNV 在不同细胞遗传学风险亚组和 VRd 治疗反应组间存在显著差异，且与 ISS 和 R - ISS 分期相关（图 3B - F）。

eccANKRD28 对患者预后的影响：在 NDMM 队列中，高 eccANKRD28 拷贝数患者的无进展生存期（PFS）显著较差，血清 ANKRD28（eccANKRD28 扩增的 eccGene）也与不良 PFS 相关，表明血清 eccANKRD28 水平可作为监测 MM 进展的风险因素和有前景的标志物（图 3G - H）。

图 3：eccANKRD28 在 NDMM 患者预测和预后分层中的潜在作用

A：所有差异 eccGenes 的通路富集分析。

B：通过 qPCR 测量 eccANKRD28 跨连接位点的拷贝数，并与多种临床指标进行 Spearman 相关性分析。

C：eccANKRD28 高、低组之间染色体异常事件的堆积条形图。

D：eccANKRD28 高、低组中高风险和标准风险细胞遗传学亚组的数量条形图。

E：eccANKRD28 高、低组之间 VRd 反应的堆积条形图。

F：ISS 阶段和 R - ISS 阶段与 eccANKRD28 拷贝数的相关性。

G：在 Renji - VRd 队列中，按 eccANKRD28 拷贝数分层的 98 例 NDMM 患者的 PFS 和 OS 的 Kaplan - Meier 曲线。

H：在 Renji - VRd 队列中，按 eccGene ANKRD28 分层的 98 例 NDMM 患者的 PFS 和 OS 的 Kaplan - Meier 曲线。

4.eccANKRD28 动态变化与 VRd 耐药及转录活性的关系

构建细胞模型及耐药性检测：运用 CRISPR 技术在 RPMI8226 细胞中生成内源性 eccANKRD28（RPMI8226 - EC），并构建硼替佐米耐药（RPMI8226 - BR）和来那度胺耐药（RPMI8226 - LR）细胞系。结果显示，RPMI8226 - BR 和 RPMI8226 - LR 细胞的 eccANKRD28 拷贝数增加，对硼替佐米和来那度胺的 IC50 值显著提高，表明 eccANKRD28 水平升高使细胞对药物治疗更不敏感（图 4A - D）。

eccANKRD28 与转录活性的相关性：DNA FISH 实验证实，在 NDMM 患者的 CD138 + BMPCs 中，eccANKRD28 信号强度与 VRd 低敏感性显著相关，且其拷贝数与转录活性呈正相关。这表明 eccANKRD28 在 MM 细胞对 VRd 耐药过程中，不仅自身拷贝数发生变化，还影响转录活性，进而影响肿瘤细胞对药物的反应（图 4G - I）。

图 4：eccANKRD28 动态变化与 VRd 耐药的发展及转录活性增强相关

A：CRISPR/Cas9 介导在 RPMI8226 细胞中生成定制 eccDNA 的示意图。

B：RPMI8226、U266 和 OPM - 2 细胞 WT 和 BR 组的代表性集落形成图像及集落形成率。

C：U266 野生型和硼替佐米耐药细胞中 eccANKRD28 和 γH2AX 蛋白表达的双免疫荧光 - FISH 图像。

D：不同细胞系对硼替佐米和来那度胺敏感性的剂量 - 反应曲线。

E：RPMI8226、U266 和 OPM - 2 细胞中 IC50 与 eccANKRD28 拷贝数的多重相关性分析。

F：eccANKRD28 诱导后及硼替佐米处理后的平均 eccANKRD28 拷贝数。

G：NDMM 患者 CD138 + 分选浆细胞中 eccANKRD28 的间期 FISH 显微镜图像。

H - I：HD/HS/LS 组中 eccANKRD28 拷贝数和 ANKRD28 mRNA 表达的 qPCR 测定结果。

5.H3K27ac 富集可视化及增强子 eccANKRD28 验证

H3K27ac ChIP - seq 分析：利用 H3K27ac ChIP - seq 技术对 ANKRD28 区域进行分析，发现 10 种 MM 细胞系（MMCLs）的 ANKRD28 区域存在强 H3K27ac 信号。通过 Cistrome DB 和 ENCODE 筛选预测，eccANKRD28 区间与多种转录因子有显著结合重叠（图 5A - C）。

增强子活性验证：ChIP - qPCR 实验表明，eccANKRD28 可直接与 H3K27ac 结合。双免疫荧光 - FISH 实验观察到在 eccANKRD28 位点有明显的 H3K27ac 高度富集信号，为从表观遗传学角度研究 eccANKRD28 在基因调控中的作用奠定了基础（图 5D - E）。

图 5：H3K27ac 富集可视化及增强子 eccANKRD28 验证

A：10 种 MMCLs 中 ANKRD28 基因区域的 H3K27ac ChIP - seq 信号轨迹。

B：eccANKRD28 的 H3K27ac 信号放大图。

C：通过 Cistrome Data Browser 预测的 eccANKRD28 区间结合因子。

D：在 RPMI8226、U266 和 OPM - 2 细胞中 eccANKRD28 与 H3K27ac 蛋白结合的 ChIP - qPCR 验证。

E：U266 中期细胞中 eccANKRD28 和 H3K27ac 共定位的共聚焦双免疫荧光 - FISH 显微镜图像。

6.增强子 eccANKRD28 通过与 POU 和 RUNX 家族相互作用促进 RRMM 的 VRd 耐药

多组学数据分析：整合 8 例 RRMM 患者的 scATAC - seq 和 scRNA - seq 数据集，发现 eccANKRD28 在 VRd 耐药组中染色质可及性增加，且与转录因子结合位点存在差异。其中，RUNX 家族主要富集在 VRd 敏感组，而 POU 家族在 VRd 耐药组更为显著（图 6A - G）。

关键转录因子与预后的关系：生存分析显示，POU2F2、RUNX1 和 RUNX2 与患者的 PFS 和 OS 呈负相关。进一步研究发现，这些关键转录因子基因在超增强子（SEs）中的表达水平明显高于典型增强子（TEs），表明 eccANKRD28 与 POU2F2 - RUNX1/2 相互作用，启动增强子效应，驱动 MM 的异常基因调控程序（图 6H - L）。

图 6：增强子 eccANKRD28 通过与 POU 和 RUNX 家族相互作用促进 VRd 耐药

A：RRMM 受试者的特征，包括 scRNA - seq 和 scATAC - seq 数据。

B - C：8 例 RRMM 患者配对的 scATAC - seq 和 scRNA - seq 数据中细胞簇的 UMAP 投影。

D：RRMM3 和 RRMM8 细胞的 QC 过滤图，展示 TSS 富集分数与独特核碎片数的关系。

E：不同 VRd 反应下 scATAC - seq 信号识别的 eccANKRD28 轨迹覆盖的共可及性分析。

F：不同 VRd 反应患者中最终确定的峰值数量条形图。

G：不同 VRd 反应中 scATAC - seq 峰值上调或下调的基序富集的 ComplexHeatmap 分析。

H：不同 VRd 反应下 POU2F2 和 RUNX1 的 TF 足迹图。

I - K：CoMMpass - VRd 队列中，POU2F2、RUNX1 和 RUNX2 表达增加与 MM 患者生存关系的 Kaplan - Meier 图。

L：通过 ROSE 分析 U266 和 OPM - 2 细胞中 H3K27ac ChIP - seq 数据确定的超增强子和典型增强子。

7.POU2F2 - RUNX1/2 - 基于的网络调节 VRd 相关癌症表观遗传学

POU2F2 的功能研究：通过 CUT&Tag 实验发现，POU2F2 可直接上调其下游 RNA 水平，且在 BR 细胞系中其蛋白水平显著增加。motif 分析表明，POU2F2 结合峰受绝缘子 CTCF 影响，与 RUNX1 和 RUNX2 转录因子基序有强烈富集（图 7A - C）。

蛋白相互作用验证：Co - IP 实验证实 POU2F2 与 RUNX1 和 RUNX2 相互作用形成蛋白复合物。ChIP - qPCR 和双免疫荧光 - FISH 实验进一步验证了 POU2F2 与 eccANKRD28 的结合及共定位关系（图 7D - G）。

下游靶基因分析：整合 CUT&Tag 和 RNA - seq 数据集，确定了 POU2F2 - RUNX1/2 网络下游的多个癌基因（如 IRF4、RUNX3、IKZF3、BCL2 和 JUNB），这些基因与药物耐药相关，并在多个数据集中得到验证（图 7I - K）。

图 7：POU2F2 - RUNX1/2 转录网络调节 VRd 相关癌症表观遗传学

A：U266 - WT 和 U266 - BR 细胞中 POU2F2 结合位点的归一化 CUT&Tag 标签密度热图及平均标签密度直方图。

B：RPMI8226 - WT、BR 和 EC 细胞中 POU2F2 的免疫印迹分析。

C：POU2F2 基因座内 CTCF、RUNX1 和 RUNX2 结合位点的基序分析。

D：在 U266 和 OPM - 2 细胞中用抗 POU2F2 抗体进行免疫沉淀，然后对指定蛋白进行印迹分析。

E：POU2F2 与 RUNX1/2 和 eccANKRD28 的蛋白质结构预测相互作用。

F：在 RPMI8226、U266 和 OPM - 2 细胞中 eccANKRD28 与 POU2F2 蛋白结合的 ChIP - qPCR 验证。

G：U266 细胞中 eccANKRD28 和 POU2F2 共定位的代表性双免疫荧光 - FISH 显微镜图像。

H：TCGA 和 MMRF - CoMMpass 中 POU2F2、RUNX1 和 RUNX2 的突变频率。

I：通过 CUT&Tag 和 RNA - seq 数据集显示 U266 - BR 细胞与 U266 - WT 细胞中差异上调基因的维恩图。

J - K：CoMMpass - VRd 队列和 Renji - VRd 队列中，按 VRd 敏感性分组的癌基因表达情况。

8.增强子 eccANKRD28 在 MM 异种移植模型中加速肿瘤生长并介导耐药

构建异种移植模型：利用免疫缺陷小鼠和 RPMI8226 - WT/EC 细胞构建异种移植模型，在接种细胞两周后，对小鼠进行不同药物处理（图 8A）。

模型实验结果：结果显示，eccANKRD28 操纵的 MM 细胞可有效促进异种移植肿瘤的生长，且使 RPMI8226 细胞对硼替佐米脱敏。组织病理学评估和 Western blot 分析表明，eccANKRD28 可诱导 POU2F2 表达增加，同时提高肿瘤中相关癌基因的 mRNA 表达水平，进一步证实了 eccANKRD28 在体内促进肿瘤生长和介导耐药的作用（图 8B - I）。

图 8：增强子 eccANKRD28 促进肿瘤进展并使 MM 细胞对 VRd 脱敏

A：使用 MM 皮下异种移植模型研究 eccANKRD28 介导耐药功能的示意图。

B：RPMI8226 - WT 或 RPMI8226 - EC 细胞形成的皮下肿瘤图像。

C：八组小鼠在终点时的肿瘤体积评估。

D：每周两次测量每组的肿瘤体积。

E：终点时的肿瘤重量分析。

F：皮下肿瘤中 POU2F2 的代表性 IHC 分析。

G：eccANKRD28 异种移植中 POU2F2 水平的免疫印迹分析。

H：用 qPCR 计算小鼠血清中 eccANKRD28 的丰度。

I：eccANKRD28 异种移植中癌基因 mRNA 表达的热图。

通过上述一系列实验，研究人员利用多种测序技术系统地分析了血清 eccDNA，发现 eccANKRD28 在 MM 耐药中发挥关键作用，为 MM 的治疗和预后评估提供了新的潜在生物标志物和治疗靶点。

本研究借助多种测序技术，如Circle-seq、RNA-seq、H3K27ac ChIP-seq、scRNA-seq、scATAC-seq和CUT&Tag等，深入剖析了多发性骨髓瘤（MM）中eccANKRD28引发耐药的机制。然而，研究仍存在一定局限性。在样本层面，相对较小的样本量可能影响研究结果的普遍性，未来需要更大规模的队列研究加以验证。

从测序技术角度来看，尽管多种测序技术的联合应用揭示了eccANKRD28相关的转录调控网络，但对于eccDNA在体内动态变化的监测，现有测序技术的灵敏度和分辨率仍有提升空间。例如，在检测低丰度eccDNA时，可能存在漏检情况。

未来研究可进一步优化测序技术流程，提高对特定eccDNA的捕获和定量准确性。同时，结合单细胞测序技术的发展趋势，深入到单细胞水平研究eccDNA的异质性及其在肿瘤微环境中的作用。还可探索新的测序技术或技术组合，以更全面地解析eccDNA的功能和调控机制。通过这些努力，有望为MM的治疗开辟新途径，如基于对eccDNA更精准的检测和分析，开发出更具针对性的靶向治疗策略，提高MM患者的生存率和生活质量。