• 目前用于治疗的基因编辑手段主要是CRISPR-Cas9系统。通过针对靶基因特定位置的引导序列（即所谓gRNA），Cas9可以将自身定位在靶基因对应的位置并触发其核酸酶活性，产生高精度的双链断裂，而后便可以通过其他手段在断裂点中插入需要的组件，或是直接沉默一个基因。gRNA的序列设计决定了敲除靶点的特异性。CRISPR-Cas9是一个具有很高特异性的切割系统，但仍然不可避免地存在脱靶问题。

     

    基于全基因组测序（WGS）的基因编辑脱靶检测，是最早出现的脱靶检测方法，其有效检测时间窗长，具有稳定、灵敏、无偏倚、方法简单的优势。

    基于全基因组测序（WGS）的

    基因编辑脱靶检测

  • 下机后的WGS数据，首先通过fastqc软件评估原始数据质量，fastp去除低质量reads和接头，再将得到的clean data比对到参考基因组，通过GATK预处理比对结果，使用Mutect2 call SNP和InDel，通过GATK注释识别出的mutant，最后通过CasOFFinder寻找潜在脱靶位点。

    分析流程

    基于WGS的脱靶检测文库构建主要分为以下几步：

     

    1、分离基因组DNA，并用超声波/酶切将其打断成一定长度的小片段

    2、添加接头

    3、PCR扩增

    4、去交联，纯化DNA，建库测序

    文库构建

  • 2020年2月，CELL Stem Cell刊发了荷兰皇家艺术与科学院医学中心Guerts团队的研究成果。该团队开发了一种基于CRISPR的腺苷碱基编辑方法，并在囊性纤维化患者肠上皮细胞培养出的类器官中使用该方法修复了致病的无义突变。

     

    腺苷碱基编辑可以将原来的A-T配对改为G-C配对，这一过程不产生双链断裂。研究人员设计了同SpCas9和xCas9融合的腺苷碱基编辑酶，并在4个囊性纤维化患者肠上皮类器官中检验定向修正的效果。全部4个类器官内同囊性纤维化相关的遗传缺陷均获得了修正，全基因组测序没有发现融合后的编辑酶存在脱靶编辑的情况，证实了该方法的安全性。

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    Total DNA样品

    Total DNA量 > 10μg

    OD 260/280应介于1.7~1.9之间

    -80℃保存，干冰寄送

     

    细胞或组织

     

    细胞量 ≥10^7个/份

     

    冻存细胞用PBS清洗后，去上清，液氮速冻后干冰寄送

     

    新鲜植物组织量 ≥3g，无菌水漂洗后吸干水分，液氮速冻，干冰寄送

     

     

    建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。

    送样时一并告知各个样本对应的sgRNA序列及靶点位置。