•        转录因子（TF）是能够与顺式作用元件特异性相互作用，并对基因转录进行激活或抑制的DNA结合蛋白；转录因子结合位点（TFBS）是转录因子调节基因表达时，与基因模板链发生结合的特定区域（5-20bp）；一个TF可以同时调控多个基因，其在不同基因上的TFBS具有一定的保守性。 通过全基因组范围内鉴定转录因子结合位点，可以更全面地了解转录因子是如何在基因组上选择特定的位置进行结合，从而实现对基因表达的精细调控，这对于揭示转录因子在各种生物过程中的作用机制具有重要作用。DAP-seq可以通过结合DNA-体外蛋白相互作用实验和高通量测序，能够高效精准地鉴定TFBS，DAP-seq通过在体外环境中重建DNA-蛋白相互作用，使得实验操作简便并能排除细胞环境对结合事件的干扰。

    DAP-seq

           DAP-seq（DNA亲和纯化测序），是一种高效的体外鉴定转录因子结合位点（TFBS）的方法；该方法是通过将体外表达的转录因子（TF）和基因组DNA进行亲和纯化，然后将TF捕捉到的DNA片段进行高通量测序，通过对高通量测序得到的序列数据进行分析确定感兴趣的TFBS(Bartlett et al.2017)。

           技术优缺点：DAP-seq技术采用体外表达标签蛋白（多为TF），将纯化蛋白与目标基因组DNA片段孵育进而确定蛋白结合序列片段，因此不需要特异性抗体，不需要转基因，可用于没有稳定遗传转化体系的物种和没有特异性抗体的目标蛋白；但缺点是DAP-seq是体外实验，而且是结合片段的基因组DNA（已经没有了体内的空间和结构信息），因此无法真实反映体内转录因子与DNA的互作。

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    1、对Raw data进行质控以及数据过滤

    2、利用clean data进行参考基因组序列比对

    3、对bam文件进行call peak

    4、对peak进行基本分析，包括peak的数量、长度、在基因组上的分布、在基因功能元件上的分布等

    5、motif分析

     

    1、组织材料的全基因组 DNA 提取，并构建 DNA文库

    2、构建转录因子的Halo-tag体外表达质粒，利用麦胚系统进行蛋白表达

    3、混合蛋白与文库，磁珠富集与目的蛋白结合的 DNA 片段

    4、多次洗涤，除去非特异结合的染色质，并纯化复合体

    5、纯化 DNA片段，测序分析

     

    文库构建

    分析流程

  • “Mapping genome-wide transcription-factor binding sites using DAP-seq” 是美国 Salk 研究所的科学家们于 2017 年在《Nature Protocols》期刊上发表的文章。该文章详细叙述了运用 DAP-Seq 技术对全基因组转录因子结合位点的检测实验和整体流程。该技术为研究转录因子的功能和调控机制提供了有力工具，有助于深入理解基因表达的调控网络，对于生物的生长发育、疾病发生等过程的研究具有重要意义。并且在农业领域，可用于研究作物中重要转录因子的结合位点，为作物改良提供线索

        DAP-Seq 技术结合了蛋白质的体外表达和高通量测序，无需为每个转录因子制备特异性抗体。因此，它具备快速、高通量和成本效益的特点，并且比 ChIP-seq 技术更容易扩展。该方法适用于大部分植物，为科学家提供了一种研究调控序列中的遗传或表观遗传变异如何影响植物性状和机制的途径。

        体外表达的蛋白和 DNA 进行亲和纯化，将与蛋白结合的 DNA 洗脱后进行高通量测序。其基本过程是将编码转录因子的 CDS 序列构建到含有亲和标签（Halo-Tag）的载体中，构建蛋白表达载体，进行体外蛋白表达，形成转录因子和亲和标签的融合蛋白；提取样品的基因组 DNA，构建 DNA 文库，然后将体外表达的带有亲和标签的转录因子和 DNA 文库进行结合，随后把结合的 DNA 洗脱后上机测序。

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    细胞样品

    1、细胞量 > 1×10^6/份；

    2、 为确保实验的顺利，建议样品备份 1~2 份。

     

     

    动物组织

    1、 组织质量> 50mg；

    2、取样时剔除冗余部分，保证组织的单一性，建议取材后用生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，液氮速冻，-80℃保存；

    3、为确保实验的顺利，建议样品备份1~2份。

     

     

     

    植物组织

    1、组织质量> 1.5g，取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，建议取样后用清水漂洗去除污物，纸巾吸干水分后液氮速冻，-80℃保存；

    2、为确保实验的顺利，建议样品备份1~2份。

     

     

     

     

    注：具体送样细节，请咨询销售。