• 环状DNA是自然界中普遍存在的一种DNA分子形式，如，细菌基因组DNA、质粒、线粒体DNA等。在真核生物中还有一类特殊的环状DNA分子，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外，以特殊的方式参与生理或病理过程。鉴于它们是独立于染色质之外的DNA分子，便统称为染色体外DNA（ecDNA），由于多是环状形式，因此统称为染色质外环状DNA（eccDNA），报道发现它们存在于多个物种，如，酵母、线虫、果蝇、哺乳动物、植物等。

     

    最初ecDNA的发现，可以追溯到1964年，由 Hotta Y和Bassel A前辈报道发现。他们选择了小麦胚乳和野猪精子进行研究，通过分离细胞核，提取DNA后进行显微观察，发现了游离于染色质之外的环状DNA分子（ecDNA）,受限于当时的技术在全基因组水平上的研究未曾有之。

     

    目前研究eccDNA强有力的方式之一是Circle-seq技术，基于质粒提取、酶切消化和高通量测序技术，根据线性DNA和环状DNA结构和化学性质的差异性，将裂解细胞通过柱纯化、去除线性DNA、滚环式扩增，三大步骤进行eccDNA的富集，结合高通量测序获取eccDNA的序列信息(Moller, Parsons et al. 2015)。

     

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    ecDNA/eccDNA

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  • 对于Circle-seq数据，数据分析流程如下：

    1、利用fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、使用BWA软件将原始数据比对到参考基因组

    3、samtools处理，以适合Circle-MAP所需的格式；

    4、采用Circle-MAP检测eccDNA；

    5、对eccDNA进行基因注释；

    6、差异eccDNA分析以及注释基因功能富集分析。

    分析流程

    Circle-seq的文库构建，主要分为以下几步：

    1、富集细胞进行裂解，提取纯化HMW DNA；

    2、进行外切酶消化线性DNA；

    3、qPCR质检线性DNA消化完全；

    4、Phi 29酶滚环扩增eccDNA;

    5、超声打断环扩eccDNA并纯化；

    6、扩增纯化产物；

    7、分选扩增后的DNA长度，去除非目的片段。

    8、上机测序。

    文库构建

  • 2018年3月，Nature Communications在线发表了题为 Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue的论文。该研究参照芽殖酵母Circle-Seq 研究eccDNA的方法，对人体组织eccDNA研究方法进行优化。在对样本中的染色体外DNA进行富集后，消除线性DNA以及线粒体DNA，对得到的eccDNA进行循环扩增。分析发现eccDNA在健康的人体组织和血液中很常见，其大小足以携带一个或几个完整的基因，并具有转录活性，推测eccDNA通过转录全长和/或基因片段促使表型产生变异。

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    本研究选取自16个健康人类的组织与血液样品，这16个人由活跃组（经常锻炼）与非活跃组（不经常锻炼）组成。研究方法参照芽殖酵母Circle-Seq研究eccDNA的方法，优化人体组织eccDNA的研究方法。在对样品中的染色体外DNA进行富集之后，去除线性DNA以及线粒体DNA，对得到的eccDNA进行循环扩增，Circ-Seq以及测序数据的分析。

    eccDNA广泛存在于人体细胞

    测序数据结果表明，在16个人肌肉样本的中共鉴定出10万多个不同的eccDNA，可以映射到所有的染色体上。长度统计分析发现eccDNA长度主要分布在0.05kb-57.8kb，不管是锻炼多还是锻炼少的人，都存在两个peak，分别位于0.1kb和5kb值左右（Fig.2a,b）。另外，作者在做文库测序之前，提取纯化环状DNA时，在不同来源的DNA样本中插入质粒DNA作为内参。不同大小的和不同浓度的质粒DNA在测序时均可以被检测出，表明实验方法的灵敏度具有可信度。

  • 细胞样品

    选取新鲜细胞进行细胞计数，液氮速冻后干冰寄送，细胞数目大于1×10^7/份，建议样品制备 2~3 份。

     

     

    动物组织

    选取新鲜组织，质量大于50mg/份，取样时剔除冗余部分，保证组织的单一性，建议取材后用生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    植物组织

    选取取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，质量大于3g/份，建议取样后用清水漂洗去除污物，纸巾吸干水分后液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    血液样品

    采血时，血清、血浆总体积大于4ml/份；-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    Total DNA样品

    寄送的Total DNA量应当 > 10μg，获取total DNA后，务必电泳检验DNA有无降解，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

    具体细节，详询销售或技术人员。