染色质外环状DNA研究利器
Circle-seq
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环状DNA是自然界中普遍存在的一种DNA分子形式，如，细菌基因组DNA、质粒、线粒体DNA等。在真核生物中还有一类特殊的环状DNA分子，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外，以特殊的方式参与生理或病理过程。鉴于它们是独立于染色质之外的DNA分子，便统称为染色体外DNA（ecDNA），由于多是环状形式，因此统称为染色质外环状DNA（eccDNA），报道发现它们存在于多个物种，如，酵母、线虫、果蝇、哺乳动物、植物等。
最初ecDNA的发现，可以追溯到1964年，由 Hotta Y和Bassel A前辈报道发现。他们选择了小麦胚乳和野猪精子进行研究，通过分离细胞核，提取DNA后进行显微观察，发现了游离于染色质之外的环状DNA分子（ecDNA）,受限于当时的技术在全基因组水平上的研究未曾有之。
目前研究eccDNA强有力的方式之一是Circle-seq技术，基于质粒提取、酶切消化和高通量测序技术，根据线性DNA和环状DNA结构和化学性质的差异性，将裂解细胞通过柱纯化、去除线性DNA、滚环式扩增，三大步骤进行eccDNA的富集，结合高通量测序获取eccDNA的序列信息(Moller, Parsons et al. 2015)。
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ecDNA/eccDNA
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对于Circle-seq数据，数据分析流程如下：
1、利用fastqc软件对原始数据进行质量评估；
2、使用BWA软件将原始数据比对到参考基因组
3、samtools处理，以适合Circle-MAP所需的格式；
4、采用Circle-MAP检测eccDNA；
5、对eccDNA进行基因注释；
6、差异eccDNA分析以及注释基因功能富集分析。
分析流程
Circle-seq的文库构建，主要分为以下几步：
1、富集细胞进行裂解，提取纯化HMW DNA；
2、进行外切酶消化线性DNA；
3、qPCR质检线性DNA消化完全；
4、Phi 29酶滚环扩增eccDNA;
5、超声打断环扩eccDNA并纯化；
6、扩增纯化产物；
7、分选扩增后的DNA长度，去除非目的片段。
8、上机测序。
文库构建
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2022年9月，西湖大学宋春青及申恩志共同通讯在Cell Research（IF=46）杂志在线发表题为 CRISPR FISHer enables high-sensitivity imaging of nonrepetitive DNA in living cells through phase separation-mediated signal amplification （介绍了一种强大的基于CRIPSR的活细胞单拷贝基因成像标记系统CRISPR FISHer）由于eccDNA体积小，用DAPI染色或DNA FISH荧光原味杂交。对其可视化具有挑战性。
作者将CRISPR FISHer用于研究活细胞中的eccDNA。首先从HepG2细胞中分离并测序eccDNA.其中，eccBEND3、eccGABRR1和eccPRKCB的序列分别通过三轮PCR、TA克隆和Sanger测序进行了独立验证。eccDNA连接序列被选为CRISPR FISHer靶向位点，因为它们在人类基因组中不存在，CRISPR FISHer能够特异靶向。
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细胞样品
选取新鲜细胞进行细胞计数，液氮速冻后干冰寄送，细胞数目大于1×10^7/份，建议样品制备 2~3 份。
动物组织
选取新鲜组织，质量大于50mg/份，取样时剔除冗余部分，保证组织的单一性，建议取材后用生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。
植物组织
选取取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，质量大于3g/份，建议取样后用清水漂洗去除污物，纸巾吸干水分后液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。
血液样品
采血时，血清、血浆总体积大于4ml/份；-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。
Total DNA样品
寄送的Total DNA量应当 > 10μg，获取total DNA后，务必电泳检验DNA有无降解，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。
具体细节，详询销售或技术人员。
