•        全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种对生物体整个基因组进行测序的技术。WGS是指对某种生物的基因组中的所有 DNA 序列进行测定，包括基因编码区和非编码区，能够获得该生物完整的遗传信息，涵盖了染色体上的所有基因、调控元件以及其他各种类型的 DNA 序列。

           技术原理

           第一代测序技术：以桑格测序法为代表，其原理是利用双脱氧核苷酸（ddNTP）终止 DNA 链的延伸，通过电泳分离不同长度的 DNA 片段，经过放射自显影阅读 DNA 序列。它准确性高，但通量低、成本高，不适合大规模的全基因组测序。 第二代测序技术：包括罗氏 454 测序技术、Solexa 测序技术、SOLiD 测序技术等。以 Solexa 测序技术为例，首先将基因组 DNA 片段化，然后将片段连接到测序接头，进行桥式 PCR 扩增，形成 DNA 簇，最后利用边合成边测序的方法，通过检测荧光信号确定每个碱基的种类，实现大规模平行测序。其特点是高通量、低成本，但读长相对较短。 第三代测序技术：如 PacBio RS 测序技术、Nanopore 测序技术等。PacBio RS 测序技术采用单分子实时（SMRT）测序，在 DNA 聚合酶作用下，荧光标记的核苷酸在合成 DNA 链时发出荧光信号，从而实现对 DNA 序列的测定，它的优势是长读长，能更好地处理重复序列、结构变异等区域。Nanopore 测序技术则是通过纳米孔让 DNA 分子通过，不同碱基通过纳米孔时会产生不同的电流变化，以此来识别碱基序列。

     

     

    全基因组测序

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  •   1. 数据质量控制。在开始测序之前，需要对测序数据的质量进行严格控制，以确保后续分析的准确性。这通常通过使用如NGS-QCGenerator等软件来完成，它可以从读数的分布中分析出质量指标。

    2. 基因组对齐。将测序得到的短 reads 序列比对到参考基因组上。常用的工具有Bowtie和BWA，这两个工具都能高效地将短 DNA 序列比对到人类基因组上。

    3. 序列可视化。为了验证候选的结构变异，可以使用如IGV（Integrative Genomics Viewer）这样的高级查看器。IGV能够处理大型异构数据集，并在各个基因组分辨率级别上提供直观的体验。

    4. 变异检测。使用如Samtools等软件来检测种系突变、体细胞突变和插入缺失。Samtools能够处理SAM/BAM/CRAM格式的读取，并支持写入、编辑、查看和格式转换。

    5. 拷贝数变异（CNV）分析。CNV分析可以使用CNVNator，这是一个从群体基因组测序中发现基因型、表征典型和非典型 CNV 的方法。它具有高灵敏度、低假阳性率和准确的基因分型特点。

    6. 短串联重复序列（STR）。分析 STR的分析可以在线操作完成。使用MISA-Web可以从 NCBI 数据库检索并分析 STR 序列。这个工具支持不同的输出格式，有助于将搜索结果集成到下游分析中。

    7. 功能预测 使用如MutationTaster和SNPDryad等工具来预测基因突变的功能。这些工具能够评估 DNA 序列改变的致病潜力，并集成来自不同生物医学数据库的信息。

    8. 变异注释 最后，将检测到的变异注释到参考基因组上，并提供关于这些变异的生物学意义解释。

    分析流程

     

           DNA 提取：从生物样本中提取高质量的基因组 DNA，确保 DNA 的完整性和纯度，以满足后续测序反应的要求。

           文库构建：将提取的基因组 DNA 进行片段化处理，然后将 DNA 片段连接到特定的载体上，构建成测序文库。

           测序反应：将测序文库放入测序仪中，按照不同测序技术的原理和方法进行测序反应，产生大量的测序数据。

           数据分析：对测序得到的海量数据进行质量控制、序列比对、变异检测等分析，以获得基因组的序列信息、基因结构、遗传变异等生物学信息。

    文库构建

  • 质量控制：

    在高通量测序中，偶尔会出现低质量读数和污染读数等问题，影响后续分析结果。因此，质量控制、对于原始数据至关重要。常用软件是NGS-QC Generator可以从特定概况关联读数的分布分析出质量指标。

    基因组对齐：

    高通量测序分析中需要将生成的读数对准（映射）到参考序列。此时可以适用Bowtie和BWA。前者能以每小时超过2500万个35 bp读数的速率比对短DNA序列（读取）与人类基因组。后者针对大型参考基因组绘制低分歧序列。

    序列可视化：

    可视化读取是使用现有数据验证候选结构变体的最有效方式。可适用IGV来完成。高性能的查看器可以有效处理大型异构数据集，同时在各个基因组分辨率级别提供直观体验。IGV的关键特征是关注研究综合性质，支持基于阵列和NGS数据，以及临床和表型数据的整合。

    变异检测：

    种系突变、体细胞突变和插入缺失检测三项检测可以使用同一个软件进行，SAMtools。SAMtools是用于与高通量排序数据进行交互的程序。可处理SAM / BAM / CRAM格式的读取，写入，编辑，查看和格式转换。

           拷贝数变异（CNV）是遗传变异常见来源，是基因组中结构变异的一种形式。通常指大于1kbp的DNA片段的重复或缺失。CNV检测可使用CNVnator，这是一种可以从群体基因组测序中发现基因型、表征典型和非典型CNV的方法。CNVnator具有灵敏度高，假阳性低，基因分型准确率高的特点。短串联重复序列（STR）是DNA重复的一种，重复单位为2-6bp，重复次数10~60多次，基因片段400bp以下。是存在于人类基因组中的具有长度多态性的DNA序列，不同数目的核心序列串联重复排列，同时呈现出长度多态性。STR的长度变异性与表型变异有关，一些疾病也由重复扩张引起。分析STR是理解个体变异性和导致不稳定机制的重要步骤。检测STR比较简单，可直接在线操作。用MISA-web ( https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/ ) 可以输入字段中指定部分从NCBI数据库中检索序列。支持两种不同的输出格式：专有的MISA和GFF3。GFF3有助于将搜索结果集成到下游分析。

  • 细胞样品

    选取新鲜细胞进行细胞计数，液氮速冻后干冰寄送，细胞数目大于1×10^7/份，建议样品制备 2~3 份。

     

     

    动物组织

    选取新鲜组织，质量大于50mg/份，取样时剔除冗余部分，保证组织的单一性，建议取材后用生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    植物组织

    选取取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，质量大于3g/份，建议取样后用清水漂洗去除污物，纸巾吸干水分后液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    血液样品

    采血时，血清、血浆总体积大于4ml/份；-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    Total DNA样品

    寄送的Total DNA量应当 > 10μg，获取total DNA后，务必电泳检验DNA有无降解，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

    具体细节，详询销售或技术人员。