• 目前用于治疗的基因编辑手段主要是CRISPR-Cas9系统。通过针对靶基因特定位置的引导序列（即所谓gRNA），Cas9可以将自身定位在靶基因对应的位置并触发其核酸酶活性，产生高精度的双链断裂，而后便可以通过其他手段在断裂点中插入需要的组件，或是直接沉默一个基因。gRNA的序列设计决定了敲除靶点的特异性。CRISPR-Cas9是一个具有很高特异性的切割系统，但仍然不可避免地存在脱靶问题。

     

    体外成环酶切效应报告测序（circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing，CIRCLE-seq），是一种用于在体外条件下检测全基因组CRISPR-Cas9系统脱靶情况的测序手法，由J Keith Joung课题组于2017年首次发表于Nature Methods。该技术通过成环和体外的Cas9酶切与接头连接分离出属于断裂点两侧的序列，同时完成建库操作。其实验手法相对简便，且对断裂点的识别可以达到单碱基级精度。

    CIRCLE-seq

  • 下机后的CIRCLE-seq数据，首先通过fastqc软件评估原始数据质量，去除接头、低质量reads，再将得到的clean data比对到参考基因组，通过CIRCLE-seq软件分析潜在的断裂点位置。最后获取断裂点前后序列等相关信息，注释断裂点所属的基因元件以及可视化。

    分析流程

    CIRCLE-seq文库构建主要分为以下几步：

    1、裂解细胞后提取全基因组DNA

    2、超声打断后成环

    3、sgRNA、Cas9、环化产物共孵育

    4、末端补平

    5、连接测序接头

    6、PCR扩增

    7、上机测序

    文库构建

  • 2017年6月，哈佛大学Shengdar Q. Tsai研究小组在Nature Methods发表了题为CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets的论文。该研究小组开发了一种通过测序在体外检测CRISPR-Cas9切割效应的方法，该方法是一种高度灵敏且高效的体外筛查方法，同Digenome-seq识别的脱靶结果相比具有更高的信噪比，而且由于其高灵敏度的特点，使用的测序reads大幅减少。

     

    研究小组比较了CIRCLE-seq与GUIDE-seq两种方法的优劣（GUIDE-seq是研究小组之前开发的一种在体全基因组脱靶位点识别方法），一共测试了6种sgRNA，CIRCLE-seq检出了GUIDE-seq识别出的几乎全部脱靶位点，另外两个CIRCLE-seq未检出的位点，其发生频率几乎处在GUIDE-seq检测能力的下限，略微增加CIRCLE-seq测序深度就可以检出这两个脱靶位点。另外CIRCLE-seq实验确定了通过高通量易位测序（HTGTS）确定的53个脱靶位点中的50个，除此之外还检出了更多的脱靶位点。

  • DNA样品

    Total DNA: ≥2ug

    OD 260/280 应在1.7~1.9之间

    -80℃保存，干冰运输

     

     

     

     

    细胞或组织

     

    细胞量 ≥10^7个/份

     

    冻存细胞PBS漂洗后去上清，液氮速冻，干冰寄送

     

     

     

    建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。

    送样时一并告知各个样本对应的sgRNA序列及靶点位置。