• 目前用于治疗的基因编辑手段主要是CRISPR-Cas9系统。通过针对靶基因特定位置的引导序列（即所谓gRNA），Cas9可以将自身定位在靶基因对应的位置并触发其核酸酶活性，产生高精度的双链断裂，而后便可以通过其他手段在断裂点中插入需要的组件，或是直接沉默一个基因。gRNA的序列设计决定了敲除靶点的特异性。CRISPR-Cas9是一个具有很高特异性的切割系统，但仍然不可避免地存在脱靶问题。

    基于ChIP的基因编辑脱靶检测方法包括针对无活性Cas9的dCas9-ChIP-seq、针对双链断裂点特异性组蛋白修饰的γH2A.x-ChIP-seq，以及针对修复蛋白复合物成分MRE11的DISCOVER-seq。三种方法各有优劣，dCas9-ChIP能较好地反映染色质空间构象和开放性对脱靶效应的影响，DISCOVER-seq则能定量分析脱靶事件。

     

    γH2A.x-ChIP-seq由Jason S. Iacovoni课题组于2010年发表于The EMBO Journal，通过描述γH2A.x在染色质上的分布，间接获取断裂点相关的信息。

     

    dCas9-ChIP-seq由Henriette O’Geen课题组于2015年发表于Nucleic Acid Research，通过ChIP和二代测序定位dCas9在双链断裂点前后的富集情况，其主要优势在于能较好反映染色质空间构象和开放性对Cas9结合的影响。

     

    Cas脱靶位点的原位发现和测序验证（discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing，DISCOVER-seq）是一种应用于细胞和组织中无偏鉴定Cas9脱靶位点的方法，由Beeke Wienert课题组于2020年首次发表于Nature Protocols。该方法的原理是通过染色质免疫沉淀和二代测序来精确地追踪MER11在DSB区的富集。该方法使用BLENDER识别全基因组的脱靶序列，能够在原代细胞和原位中发现和测量脱靶位点，其主要优点是假阳性率低，并适用于包括病人细胞和动物模型在内的各种系统。

    基于ChIP的

    基因编辑脱靶检测

  • 下机后的ChIP-seq数据，首先通过fastqc软件评估原始数据质量，去除低质量reads和接头，再将得到的clean data比对到参考基因组，依据ChIP的靶蛋白选择相应的软件分析潜在的断裂点位置。最后获取断裂点前后序列等相关信息，注释断裂点所属的基因元件，通过DISCOVER-seq内带的BLENDER模块可视化。

    分析流程

    文库构建主要分为以下几步：

    1、甲醛交联细胞系，将目标蛋白与染色质连接

    2、分离基因组DNA，并用超声波/酶切将其打断成一定长度的小片段

    3、添加与目标蛋白质特异的抗体，形成抗体与目标蛋白的免疫沉淀免疫结合复合体

    4、去交联，纯化DNA，建库测序

    文库构建

  • 2019年4月Science发表了题为Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq的研究文章。研究工作由美国加州大学伯克利分校分子生物学系和遗传学创新研究所联合完成，第一作者Beeke Wienert和Stacia K. Wyman。

    研究小组开发了一种利用细胞和生物体中DNA修复因子的招募过程实现的无偏脱靶识别方法，通过追踪MRE11的精确募集，以单碱基精度识别了细胞中Cas活动的分子特点，适用于多种sgRNA和Cas酶系统，可以应用于新的遗传编辑工具。该方法可以在细胞系和患者来源的诱导多能干细胞中，以及腺病毒编辑过的小鼠中识别脱靶，为在治疗基因组编辑过程中发现患者个体基因型的原位脱靶识别铺平了道路。

     

    研究者使用两种已经充分研究过的sgRNA（针对人K562细胞中的“VEGFA_site2”和小鼠B16-F10细胞的“Pcsk9-gP”）测试了DISCOVER-seq在无偏脱靶检测方面的性能。DISCOVER-seq识别出了VEGFA_site2的57个脱靶位点和Pcsk9-gP的45个脱靶位点。通过扩增子二代测序（amplicon-NGS）验证后发现，DISCOVER-seq识别出的并接受测试的所有脱靶位点的插入/缺失率均高于背景。研究者随后进一步使用无脱靶靶点的RNF2和Pcsk9-gM gRNA以及带有两个脱靶靶点的HBB靶向指针测试了DISCOVER-seq 。 DISCOVER-seq正确地识别出了这些gRNA的靶点，并且没有假阳性。研究者发现，在sgRNA插入序列的5’端增加一个鸟嘌呤能减少脱靶，但效应不均一。关于酶的特异性， DISCOVER-seq发现高保真（HiFi）Cas9突变体更少发生脱靶。DISCOVER的评分与多种背景下indel的最终频率高度相关，使用VEGFA_site2 gRNA在K562细胞中比较DISCOVER-seq和GUIDE-seq，研究者发现大量位点重叠，也发现了两种方法各自独有的位点。 DISCOVER-seq与indel率的相关性比GUIDE-seq更密切，研究者根据经验确定了DISCOVER-seq的敏感性阈值为0.3% indel。总的来说， DISCOVER-seq在对多种Cas核酸酶和gRNA进行无偏和定量脱靶鉴定方面表现良好。 

  •  

    细胞或组织

     

    细胞量 ≥10^7个/份，两份起送

    新鲜细胞置于密封好的培养皿或培养瓶，常温运输

     

     

    新鲜动物组织量 ≥100mg，生理盐水漂洗后液氮速冻，干冰寄送

     

     

     

    建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。

    送样时一并告知各个样本对应的sgRNA序列及靶点位置。