• ChIP-Seq是研究目的蛋白在染色质上的定位及丰度的经典方法,ChIP-Seq虽使用广泛,但是有一些局限性,而且甲醛交联可能会掩盖一些结合位点和假阳性结合位点。因为是从可溶的全基因组取样,所以ChIP-Seq往往有较高的背景,需要深度测序才可以提高信噪比。

    Henikoff实验室提出的CUT&RUN(Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease)是一种研究各种染色质相关蛋白及其修饰的全基因组分布的表观遗传学方法。和ChIP (Chromatin Immunoprecipitation)相似,CUT&RUN也是利用抗体靶向染色质相关修饰和蛋白,但其所需细胞量和测序深度比传统ChIP更低2-4。 在CUT&RUN中,抗体靶向目标蛋白从而结合在完整细胞中的染色质上,然后微球菌核酸酶 (MNase) 在目标蛋白结合位点特异性地剪切DNA,所释放的DNA片段被纯化、测序并定位到参考基因组序列上,就可推断出蛋白在DNA上的结合位点。ChIP需要将蛋白与DNA交联,这一步可能导致假阳性,而CUT&RUN不需要交联反应。 作为研究染色质相关蛋白的极佳工具,CUT&RUN灵敏、特异性高且所需细胞量比ChIP更少,是研究转录因子等染色质相关蛋白的结合方式和全基因组的组蛋白修饰的理想方法。染色质相关蛋白在调控诸如基因表达、DNA复制、DNA修复和细胞分化等过程中发挥很重要的作用,研究这些蛋白的结合方式可以为这些细胞活动的调控提供潜在思路。

     

    CUT&RUN

  • 对于CUT&RUN数据分析,首先利用fastqc软件对原始数据进行质量评估;再使用BWA或bowtie软件将原始数据比对到参考基因组;然后用MACS分别对每例样本进行峰挖掘(peak calling),之后对 peaks 区域进行基因组位置注释、motif分析,并对靶基因进行GO和KEGG富集分析;若具有多种实验组样本,可挖掘各组样本间具有差异的peaks进行特异性分析等。

    分析流程

    关于CUT&RUN的文库构建,主要分为以下几步:

    1、珠子的活化;

    2、珠子与细胞的结合;

    3、孵育抗体;

    4、结合pAG-MNase;

    5、纯化片段化后的DNA;

    6、DNA洗脱与测序;

     

    文库构建

  • 2023年3月1日,中国科学院上海营养与健康研究所丁秋蓉研究组在Molecular Cell杂志在线发表了题为“Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting”的研究论文。该研究发现了组蛋白H3S28磷酸化(H3S28ph)响应饥饿情况下胰高血糖素信号,直接调控肝脏糖异生基因转录激活的生物学机制:在饥饿状态下,胰高血糖素激活PKA信号通路,PKA继而被CREB招募到基因组糖异生基因调控区域,磷酸化H3S28。磷酸化的H3S28ph被14-3-3ζ识别,招募更多的RNA聚合酶II(Pol II),激活糖异生基因转录。并发现进食状态下,PP2A作为H3S28ph的磷酸酶抑制其磷酸化,继而抑制糖异生基因的表达。该研究发现了组蛋白磷酸化在肝脏糖稳态调控中的生物学功能,并发现了CREB作为桥梁蛋白介导PKA磷酸化H3S28继而调控糖异生基因转录的调控模式。

  • 细胞样品

    单次ATAC-seq反应所需细胞应当严格控制在100,000个/管(每个样本准备3~4管),具体细节详询销售

     

     

    动物组织

    选取新鲜组织,质量大于30mg/份,取样时剔除冗余部分,保证组织的单一性,建议取材后用生理盐水漂洗,以去除血渍和污物,液氮速冻,-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    植物组织

    选取取幼嫩组织,如嫩叶,根尖,幼苗等,质量大于500mg/份,建议取样后用清水漂洗去除污物,纸巾吸干水分后液氮速冻,-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

    具体细节,详询销售或技术人员。