•          单细胞分辨率转录组技术的出现，开启了发育生物学的新时代，使该领域的研究达到了高度精细的水平。它允许对组织的复杂性和异质性进行探索分析，也将有助于我们揭示潜在的表观遗传调控过程。单细胞测序技术为基因调控网络提供了更深入的见解。

             单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）建库系统基于液滴微流控技术，采用突破性的微球 - 分子标签技术，携带千万级别的分子标签，能够捕获多种样本中的 mRNA 分子，以此确保构建的文库具有稳定的质量和出色的性能。其步骤主要包括单细胞分离和捕获、细胞裂解、反转录、cDNA 扩增以及文库制备。随着多种测序技术的快速发展，单细胞文库制备及测序技术也呈现出多样化的趋势。

              scRNA-seq 技术让研究人员可以在单细胞层面分析转录组，从而精确地揭示肿瘤细胞的异质性。例如，黑色素瘤中是否存在同样多样化的基质细胞亚群，以及这些亚群的组成和功能如何随肿瘤的发展而变化，仍有待探索。因此，我们运用 scRNA-seq 技术实时研究发展中的肿瘤微环境，揭示了以前未被认识到的特征和不断增加的异质性。单细胞测序能够展现细胞异质性并揭示罕见细胞群体。肿瘤微环境的异质性和动态性质，使得确定不同免疫和基质成分的作用颇具挑战性。scRNA-seq 的出现，让我们能够更深入地了解肿瘤生物学，揭示出以前的方法无法检测到的肿瘤内异质性的真实程度。我们运用 scRNA-seq 方法对不断变化的肿瘤微环境及相关淋巴结内的肿瘤景观进行表征，确定了抑制性免疫微环境在肿瘤中的逐渐发展，以及具有不同功能特征的离散基质亚群。总之，我们展示了单细胞 RNA 测序在定义肿瘤微环境景观方面的强大作用，为确定具有治疗潜力的候选对象提供了资源。

    真核3'单细胞转录组测序

    产品优势

    应用方向

  • 3'scRNA-seq的文库构建主要分为以下几步：

    1. 制备单细胞悬液。

    2. 进行液滴生成。

    3. 开展液滴内的反转录反应。

    4. 对含有反转录产物的液滴进行破乳处理。

    5. 对破乳后的产物进行过滤操作。

    6. 对过滤后的产物进行清洗。

    7. 进行纯化cDNA的步骤。

    8. 进行预扩增。

    9. 完成文库构建并上机测序。

    技术流程

     

    获得下机测序数据后，我们通过以下流程进行分析：

    1. 利用mobivision软件对原始数据进行质控并转换。

    2. 使用cutadapt过滤接头序列与低质量序列。

    3. 使用STAR软件将Clean Data比对到参考基因组。

    4. 采用samtools对sam文件进行处理并整理排序。

    5. 使用mobivision软件生成下游分析所需的单细胞计数矩阵。

    6. 借助R相关包实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。 

     

    分析流程

    靶向DNA切割原理

  •          这篇发表在《Gut》（影响因子31.79）上的文章，题为“Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment”，深入探索并解析了中性粒细胞在胰腺癌（PDAC）中的异质性及其促肿瘤机制。研究通过单细胞RNA测序分析揭示了BHLHE40驱动的具有高度活化的糖酵解作用的促肿瘤中性粒细胞在胰腺肿瘤微环境中的特性。

           在本研究中，作者对 PDAC 患者外周血中性粒细胞和 PDAC 组织免疫细胞进行了单细胞转录组测序，阐释了 PDAC 患者肿瘤微环境中肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的异质性，发现并证实了新的 TANs 亚型，还揭示了 TANs 促肿瘤的分子机制，为 PDAC 的治疗提供了潜在有力的先天免疫靶点。

           对PDAC患者的中性粒细胞群体（PMNs和TANs）进一步聚类分析发现，两类中性粒细胞分别由6个细胞亚群组成（PMN-(0:5)，TAN-(0:5)）。但由于PMN-5表达嗜酸性粒细胞分子标记，TAN-5细胞数据质量欠佳，在下游分析中被剔除。

           相关性分析显示，所有PMN细胞亚群表达谱相似，而TAN细胞亚群间差异显著，表明肿瘤浸润的TANs具有异质性。其中，TAN-1高表达与癌症进展、转移相关的分子标记，相关通路富集到趋化因子、细胞因子和血管生成因子等；TAN-2高表达炎症相关基因，不仅富集到与TAN-1类似的生物过程，还涉及免疫相关信号通路；TAN-3与PMNs细胞表达谱较相似，高表达与中性粒跨内皮迁移相关的基因，是PMNs向TANs转化的过渡态细胞类型，富集到抗原提呈等过程；TAN-4特异性高表达IFN激活相关基因，富集到天然免疫信号通路。通路活性分析结果也印证了上述TANs的特征。

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    新鲜组织样品

    1. 组织保存液标准为5mL/样品，组织块大小需满足体积≥8mm³或质量≥40mg。若收到的组织保存液暂不使用，应存放在4℃冰箱。

    2. 建议取材后用生理盐水漂洗，以去除血渍和污物。同时，建议制备1 - 2份样品，并在4℃条件下运输。

     

     

    冰冻动物组织

    1. 用于提核的动物组织样本，要求组织质量>100mg且新鲜，可采用液氮速冻、干冰运输的方式。

    2. 用预冷的PBS将样本表面的血和筋膜冲洗干净，再用吸水纸或纱布吸干表面水分。

    3. 操作时要迅速，全程在冰上进行。将组织放入冻存管后，迅速浸入液氮中速冻2min以上，随后放入液氮中长期保存。

    4. 在冻存管上做好样本信息标记。为确保实验顺利，建议备份1 - 2份样本，采用干冰运输。

     

     

    全血、骨髓血、贴壁或悬浮培养的细胞等样品类型

    1. 全血或骨髓血样品应放在EDTA抗凝管（紫帽）中保存，样品量不少于3ml，保存后需充分混匀再运输。贴壁或悬浮培养的细胞，总细胞量不少于5×10⁵。

    2. 运输过程中要做好缓冲保护。将抗凝管或细胞培养瓶放入密封袋，再用运输缓冲包装（如气柱袋）包起来，放入泡沫箱。

    3. 尽量固定好样本，避免样本晃动或剧烈震荡导致细胞破裂，常温（4 - 18℃）运输。

     

     

    脑脊液、腹水、胸水等体液类样品

    1. 提取体液后，直接放入15ml或50ml离心管中，并做好标记。

    2. 运输过程中要做好缓冲保护。用封口膜封好离心管，再用运输缓冲包装（如气泡膜、气柱袋）包裹样本，防止样本冻结凝固，然后将样本放进泡沫箱。

    3. 尽量固定好样本，避免样本晃动或剧烈震荡导致细胞破裂，在4℃条件下运输。

     

     

    冻存PBMC、冻存细胞系、冻存的组织消化的原代细胞

    1. 冻存样本要求每个样本的数量不低于1×10⁶。冻存时需梯度冻存，使用细胞液氮冻存管，在液氮罐中妥善保存。

    2. 采用干冰运输。邮寄前，将冻存样本从冻存环境中取出并做好包装，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，在样本上下和四周都填满干冰，封好泡沫盒后进行运输。