•        目前研究发现RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）是调节基因表达的关键因素。RBP功能缺失会导致很多疾病，例如神经病变，自身免疫缺陷和癌症等。为研究RBPs调控RNA的机制，涌现出大量的新技术如RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP），紫外交联免疫沉淀（crosslinking-immunoprecipitation，CLIP）等。

           随着NGS的广泛应用，开发出了多种研究技术，如：RIP-seq、MeRIP-seq、CLIP-seq、iCLIP-seq、eCLIP-seq、hiCLIP-seq等。其中eCLIP-seq（enhanced CLIP-seq）应用广泛，不仅能实现单碱基水平的分辨率，还能以更强大的框架方式在全基因组范围内mapping RBPs信息。在显著降低测序过程所需的扩增次数同时，极大地提高了RBPs文库可读百分比的成功率，并改善了配对input的信噪比。

    eCLIP-seq

  • 获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1、Fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、Cutadapt过滤接头序列与低质量序列；

    3、STAR软件将Clean Data比对到参考基因组；

    4、Picard去除PCR重复序列；

    5、Samtools处理比对结果，构建index；

    6、Clipper鉴定reads富集区域；

    7、对比input样本数据

    8、标准化处理，计算高富集区域；

    9、使用Homer2完成motif分析；

    10、利用R语言实现数据统计、制图、差异分析等。

    分析流程

    eCLIP-seq文库构建，主要分为以下几步：

    1、紫外交联，裂解细胞；

    2、将抗体与磁珠结合；

    3、RNAse处理裂解液；

    4、磁珠捕获RBP-RNA复合体；

    5、转膜；

    6、蛋白酶K处理，纯化RNA；

    7、反转录，纯化cDNA；

    8、连接接头，PCR扩增cDNA；

    9、构建文库，上机测序

    文库构建

  •         RNA结合蛋白（RBPs）通过与靶标RNA分子的相互作用在细胞生理过程中发挥关键调控作用，其结合位点的精准鉴定对于解析RBPs的功能机制至关重要。紫外交联免疫沉淀（CLIP）技术作为研究RBP-RNA相互作用的核心手段，虽经PAR-CLIP、iCLIP等改进实现了单核苷酸分辨率的结合位点检测，但传统CLIP方案存在操作复杂、文库复杂度低、实验失败率高等局限，严重制约了RBPs功能研究的规模化推进。在此背景下，发表于高影响因子期刊《Nature Methods》（2023年影响因子约47.990）的研究论文《Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP)》（2016年3月28日在线发表，DOI: 10.1038/nmeth.3810）提出了增强型CLIP（eCLIP）技术，为解决上述问题提供了突破性方案。

            该研究由Eric L Van Nostrand等学者团队完成，通过优化接头连接策略（采用两步法接头连接并提高连接效率至90%以上）、简化实验流程（缩短操作时间至4天）、引入配对的IgG对照和大小匹配的输入对照（SMInput）等改进，使eCLIP的扩增需求降低约1000倍，PCR重复序列丢弃率减少约60%，同时保持单核苷酸分辨率的结合位点检测能力。研究团队在HepG2和K562细胞中对73种不同RBPs完成了102组eCLIP实验，验证了其在大规模、稳健性 profiling RBP结合位点中的优势，为解析RBPs的因子特异性结合谱、识别CLIP实验常见假阳性以及构建RNA中心视角的RBP活性网络提供了强有力的技术支撑。接下来，我们将围绕该文献展开深入探讨，解析eCLIP技术的创新点及其在RNA生物学研究中的应用价值。

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    1、紫外交联的细胞或组织。

    2、干冰运输。

    3、建议提供备份样品。

     

    注：具体送样细节，请咨询销售。

     

     

     

     

     

     

     

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