•       微生物3'转录组测序采用液滴式微流控芯片技术形成数十万个液滴,可对多种样本自动完成单细胞分离、细胞裂解、核酸捕获,是高质量、端到端的高通量单细胞测序建库。我们采用的是突破性的微球—分子标签技术,携带千万级别的分子标签,针对多种样本的 mRNA 分子进行捕获及完成逆转录,确保构建文库质量稳定、性能出色。步骤主要包括单细胞分离和捕获、细胞裂解、反转录、cDNA扩增和文库制备。随着多种测序技术的快速发展,单细胞文库制备及测序技术也呈现出多样化的趋势。

     

    微生物3'转录组测序

  • 1、基于半随机引物原理,在对细胞进行固定、通透化、细胞壁裂解、gDNA去除等步骤

    2、在细胞内完成mRNA分子的捕获和第一轮预索引,随后对cDNA的3’端添加polyA尾巴

    3、在液滴内完成cDNA二链合成和第二轮索引条形码标记

    4、通过NGS文库构建和测序即可获得单个微生物细胞的转录组信息

    5、基于半随机引物原理可对RNA分子全长进行无偏捕获。

    技术流程

     

    1、细胞标签提取与纠错

    2、测序数据质控

    3、参考基因组对比

    4、基因定量

    5、生成表达矩阵

    6、生成可视化报告

     

    分析流程

    靶向DNA切割原理

        基因表达数量分布图 (纵坐标:单个细菌中检测得到的基因数目;横坐标:物种名称)

     

           用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种物种进行的单细胞转录组实验数据表明,物种之间可以得到良好的分群结果,证明了方法学的有效性。

       

  •       2023年发表在Cell的文章,题目为“Bacterial droplet-based single-cell RNA-seq reveals antibiotic-associated heterogeneous cellular states”。文章介绍了BacDrop,这是一种基于液滴的细菌单细胞RNA测序技术,可扩展到数百万个细菌细胞或数百个样本,并且可阐明由抗生素耐药性和持久性导致的不同表型结果相关的不同转录的细菌亚群。基于液滴微流控技术开发了BacDrop,利用10x Genomics平台,实现比基于平板方法更高的检测通量。与哺乳动物细胞相比,细菌的两个独特特征是,在保持RNA完整性的同时,裂解细菌细胞壁需要更苛刻的裂解条件,并且缺乏mRNA聚腺苷化的尾部,因此需要从更丰富的rRNA (95%)中分离mRNA (5%)。为了克服这些问题,作者采用了先前报道的细胞固定和渗透方案,以避免在液滴包封之前细胞的裂解,并分别使用RNase H和DNase I在渗透固定细胞内实施通用rRNA和基因组DNA (gDNA)移除步骤。

     

           作者使用多编码策略克服基于液滴的单细胞方法中每个微流体通道可加载细胞数量受限的问题。其中使用两个编码的组合来唯一识别细胞:首先,“plate barcode”(CB1)作为预索引步骤,对应于通过逆转录(RT)获得的384种不同编码中的一种,其次,“液滴编码”(CB2)通过使用10x Genomics试剂盒唯一识别每个液滴,每个液滴包含3-6个细胞。CB1和CB2共同构成细胞编码。这种预索引策略最近已成功应用于哺乳动物scRNA-seq。通过预索引,能在每个液滴中装载多个细胞,从传统液滴scRNA-seq实验的平均液滴占用值(λ)~0.3显著增加至> 1。此外,与哺乳动物mRNA相比,细菌合成第二链cDNA的模板转换效率较低,因为细菌mRNA的5’端缺乏适当的修饰。因此,作者使用末端转移酶(TdT)将poly(A)尾附加到cDNA的3’端,以促进在液滴内合成第二链cDNA。

     

           使用多编码策略克服基于液滴的单细胞方法中每个微流体通道可加载细胞数量受限的问题。其中使用两个编码的组合来唯一识别细胞:首先,“plate barcode”(CB1)作为预索引步骤,对应于通过逆转录(RT)获得的384种不同编码中的一种,其次,“液滴编码”(CB2)通过使用10x Genomics试剂盒唯一识别每个液滴,每个液滴包含3-6个细胞。CB1和CB2共同构成细胞编码。这种预索引策略最近已成功应用于哺乳动物scRNA-seq。通过预索引,能在每个液滴中装载多个细胞,从传统液滴scRNA-seq实验的平均液滴占用值(λ)~0.3显著增加至> 1。此外,与哺乳动物mRNA相比,细菌合成第二链cDNA的模板转换效率较低,因为细菌mRNA的5’端缺乏适当的修饰。因此,作者使用末端转移酶(TdT)将poly(A)尾附加到cDNA的3’端,以促进在液滴内合成第二链cDNA。

     

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    新鲜细胞样品

    取菌液(10^8~10^10个细胞)

     

     

     

     

     

    具体送样细节,请咨询销售。