GUIDE-seq
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目前用于治疗的基因编辑手段主要是CRISPR-Cas9系统。通过针对靶基因特定位置的引导序列(即所谓gRNA),Cas9可以将自身定位在靶基因对应的位置并触发其核酸酶活性,产生高精度的双链断裂,而后便可以通过其他手段在断裂点中插入需要的组件,或是直接沉默一个基因。gRNA的序列设计决定了敲除靶点的特异性。CRISPR-Cas9是一个具有很高特异性的切割系统,但仍然不可避免地存在脱靶问题。
全基因组无偏双链断裂点测序(genome-wide, unbiased identification of DSBs enabled by sequencing, GUIDE-seq)是一种用于在体外条件下检测全基因组CRISPR-Cas9系统脱靶情况的测序手法,由Shengdar Tsai课题组于2015年首次发表于Nature Biotechnology。该技术通过Cas9切割基因组、标记寡核苷酸整合、体外随机打断基因组序列和接头连接分离出断裂点两侧的序列,同时完成建库操作。该方法可以识别平头和黏性末端核酸酶造成的双链断裂,适合基于Cas9的基因编辑治疗前脱靶风险的评价。
GUIDE-seq
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2015年2月,哈佛大学Shengdar Q. Tsai研究小组在Nature Biotechnology发表了题为GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases的论文。该研究小组开发了一种通过测序检测CRISPR-Cas9切割效应的方法,该方法高度灵敏且高效,由于采用定向扩增方法构建文库,测序reads需求较少。
研究者使用10种不同的sgRNA测试了GUIDE-seq的能力,发现这10种sgRNA导致的切割位点数量差异较大,这种数量差异同sgRNA的GC含量、靶点在基因组上的位置无关,检出的切割位点在整个基因组范围内皆有分布。GUIDE-seq检出的切割位点中包含了4种sgRNA的全部28个已知脱靶位点。