• 目前用于治疗的基因编辑手段主要是CRISPR-Cas9系统。通过针对靶基因特定位置的引导序列（即所谓gRNA），Cas9可以将自身定位在靶基因对应的位置并触发其核酸酶活性，产生高精度的双链断裂，而后便可以通过其他手段在断裂点中插入需要的组件，或是直接沉默一个基因。gRNA的序列设计决定了敲除靶点的特异性。CRISPR-Cas9是一个具有很高特异性的切割系统，但仍然不可避免地存在脱靶问题。

     

    全基因组无偏双链断裂点测序（genome-wide, unbiased identification of DSBs enabled by sequencing, GUIDE-seq）是一种用于在体外条件下检测全基因组CRISPR-Cas9系统脱靶情况的测序手法，由Shengdar Tsai课题组于2015年首次发表于Nature Biotechnology。该技术通过Cas9切割基因组、标记寡核苷酸整合、体外随机打断基因组序列和接头连接分离出断裂点两侧的序列，同时完成建库操作。该方法可以识别平头和黏性末端核酸酶造成的双链断裂，适合基于Cas9的基因编辑治疗前脱靶风险的评价。

    GUIDE-seq

  • 下机后的GUIDE-seq数据，首先通过fastqc软件评估原始数据质量，去除低质量reads，再将得到的clean data比对到参考基因组，通过GUIDE-seq软件分析潜在的断裂点位置。最后获取断裂点前后序列等相关信息，注释断裂点所属的基因元件以及可视化。

    分析流程

    GUIDE-seq文库构建主要分为以下几步：

    1、细胞内通过Cas9切割基因组

    2、整合寡核苷酸标记

    3、提取基因组DNA并随机打断

    4、末端补平

    5、连接测序接头

    6、PCR扩增

    7、上机测序

    文库构建

  • 2015年2月，哈佛大学Shengdar Q. Tsai研究小组在Nature Biotechnology发表了题为GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases的论文。该研究小组开发了一种通过测序检测CRISPR-Cas9切割效应的方法，该方法高度灵敏且高效，由于采用定向扩增方法构建文库，测序reads需求较少。

    研究者使用10种不同的sgRNA测试了GUIDE-seq的能力，发现这10种sgRNA导致的切割位点数量差异较大，这种数量差异同sgRNA的GC含量、靶点在基因组上的位置无关，检出的切割位点在整个基因组范围内皆有分布。GUIDE-seq检出的切割位点中包含了4种sgRNA的全部28个已知脱靶位点。

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    细胞或组织

     

    细胞量 ≥10^7个/份

     

    冻存细胞PBS漂洗后去上清，液氮速冻，干冰寄送

    细胞需要预先经过sgRNA-Cas9复合物转染，再转染dsODN。

    转染dsODN后至少24小时再行冻存。

     

     

     

    建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。

    送样时一并告知各个样本对应的sgRNA序列及靶点位置。