• RNA修饰是指发生在RNA分子上的各种化学修饰（已超160种），每种修饰都有相应的功能，如：稳定结构、出核运输、可变剪接、翻译识别等。其中甲基化修饰约占2/3，RNA的甲基化修饰多位于mRNA、tRNA、rRNA和其他非编码RNA上。m1A（N1-methyladenosine）便是其中之一，该修饰在非编码RNA和mRNA上普遍存在，在人类细胞中，m1A存在于线粒体tRNA和细胞质tRAN的9位和第58位核糖腺苷酸上，m1A修饰在维持这些非编码RNA的结构和功能方面起着重要作用。除了存在于非编码RNA，在于哺乳动物mRNA上也存在m1A修饰，且在5’UTR区有较多的呈现。随着NGS的广泛应用，RNA修饰得到了广泛研究，已是表观遗传领域的热点之一，而MeRIP-seq则是研究m1A修饰强有力的技术之一。该技术是将MeDIP、RIP及RNA-seq技术结合起来，在全基因组范围内精确检测RNA甲基化，对RNA样品进行片段化，利用特异性的RNA甲基化抗体进行免疫共沉淀反应，将获得的甲基化修饰片段测序。同时，需要设计Input对照样（类似与ChIP-seq）消除背景。

     

    m6A-meRIP-seq

  • 对于获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1、Fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、用BWA软件将Clean Data比对到参考基因组；

    3、Samtools对sam文件进行处理，整理排序并去除重复序列；

    4、MACS2进行Peak calling (q = 0.01)，寻找测序读段高覆盖峰；

    5、Deeptools对覆盖峰进行注释，并完成motif分析；

    6、借助R语言实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。

    分析流程

    构建meRIP-seq文库，主要分为以下几步：

    1、提取总RNA，使用DNase I，去除DNA污染；

    2、沉淀RNA，乙醇洗涤，将产物置于超纯水中；

    3、测RNA浓度，热循环仪中孵育将RNA片段化；

    4、评估RNA片段化大小（200nt左右）；

    5、加入抗m1A抗体孵育；

    6、洗脱富集RNA；

    7、构建cDNA文库；

    8、上机测序。

    文库构建

  • 2016年《Nature Chemical Biology》发表了北京大学生命科学学院蛋白质和植物基因研究的国家重点实验室的研究成果。研究表明：人mRNA中普遍存在m1A修饰，且m1A/A比率为0.02％，除此之外，在m1A免疫沉淀和m1A抑制逆转录的固有能力的基础上开发了m1A-ID-seq技术，用于转录组范围内鉴定m1A修饰，可在mRNA和非编码RNA中识别901个m1A峰（来自600个基因），并在mRNA转录的5个非翻译区域富集，与哺乳动物mRNA内部最丰富的的修饰N6-甲基腺苷模式不同。另外，mRNA中的m1A可通过已知的DNA/RNA脱甲基酶ALKBH3逆转，并证明了m1A甲基化对刺激具有动态反应，识别了数百个压力诱导的m1A位点。总的来说，该方法对m1A修饰进行全面分析，研究可逆和动态的m1A甲基化，并为表观遗传调控的功能研究提供工具。

    更多内容 ꅀ

    N1-甲基腺苷（m1A）是一种普遍的转录后RNA修饰，但其mRNA的丰度，拓扑和动力学知之甚少。

    m1A在rRNA和tRNA中大量富集，通常在tRNAT-loop的58位，由细胞质tRNAs2的必需tRNA (m1A58)甲基转移酶复合物(Trmt6和Trmt61A)或Trmt61B对线粒体tRNAs3的催化，m1A58在引发剂tRNAMet中被完全修饰并稳定其三级结构，而该位置对25%的其他tRNA物种来说是低镁化的，影响其与多核糖体的关联，从而影响其在翻译中的效用。

    tRNA中的m1A可以对环境胁迫做出反应，rRNA中的m1A可以影响核糖体的生成，介导细菌的抗生素耐药性。

    可逆甲基化最近已成为哺乳动物细胞表观遗传调控的一个突出机制。ALKBH3，它是大肠杆菌AlkB的人类同源物，已被证明可以在体外修复RNA的甲基化损伤。

  • RNA样品

    （常量）: Total RNA: ≥300ug，RIN值要＞7.5；

     

     

    细胞或者组织

    细胞量 ≥30million（常量）；

     

    动物组织量 ≥500mg；植物组织量 ≥5g；建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。