• RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）是调节基因表达的关键因素。RBP功能缺失会导致很多疾病，例如神经病变，自身免疫缺陷和癌症等。为研究RBPs调控RNA的机制，涌现出大量的新技术如RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP），紫外交联免疫沉淀（crosslinking-immunoprecipitation，CLIP）等(Ule et al., 2003)。 随着NGS的广泛应用，人们开发出了多种研究技术，如RIP-seq、meRIP-seq、CLIP-seq、iCLIP-seq、eCLIP-seq、hiCLIP-seq等。其中RIP-seq技术是利用靶蛋白的抗体拉下相应的RNA-蛋白复合物，然后将复合物上的RNA片段分离纯化出来，结合高通量测序技术，帮助研究人员发现靶标信息。目前RIP-seq已是研究转录后调控的有力工具之一，并广泛用于组学的研究领域(Head S R et al., 2014)。

    RIP-seq

  • 获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1.利用fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2.使用cutadapt过滤接头序列与低质量序列；

    3.使用STAR软件将Clean Data比对到参考基因组；

    4.采用samtools对sam文件进行处理，整理排序并去除重复序列；

    5.使用MACS2进行Peak calling，寻找测序读段高覆盖峰；

    6.使用bedtools对覆盖峰进行注释，使用HOMER完成motif分析；

    7.借助R相关包实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。

     

    分析流程

    RIP-seq文库构建，主要分为以下几步：

    1.裂解细胞；

    2.抗体孵育，免疫共沉淀；

    3.富集复合体；

    4.回收RNA；

    5.反转录cDNA；

    6.添加测序接头，纯化；

    7.PCR扩增cDNA；

    8.上机测序。

    9.构建文库，上机测序

    文库构建

  •      《Genome - wide identification of Wig - 1 mRNA targets by RIP - Seq analysis》由Cinzia Bersani等人撰写，于2015年12月11日发表在*Oncotarget*杂志第7卷第2期。RNA结合蛋白在基因表达调控中意义重大，其中Wig - 1作为p53诱导的RNA结合蛋白，能通过锌指结构域结合RNA ，对多种mRNA稳定性产生影响。为全面探究Wig - 1的作用机制，该研究运用RIP - Seq技术，对HCT116和Saos - 2细胞中与Wig - 1结合的mRNA展开系统性分析，为深入理解p53依赖的应激反应和肿瘤抑制机制提供了新视角。

           文章使用的RIP-seq技术，优势在于：1. 可在一次实验中探测RNA结合蛋白的整个靶mRNA库，有助于全面了解RNA结合蛋白的作用范围。 2. 能够识别与RNA结合蛋白有较强且更稳定相互作用的RNA伙伴，可用于确定重要的RNA - 蛋白相互作用。

           文章通过RIP - seq在HCT116和Saos - 2细胞中对Wig - 1结合的mRNA进行研究，得到了一系列重要结论。共鉴定出286个在两种细胞系中共同的Wig - 1结合mRNA，序列分析显示这些mRNA的3′UTR富含AU富集元件（AREs） 。网络富集分析表明Wig - 1优先结合参与细胞周期调控的mRNA，且整合RIP - seq与之前基因表达数据发现209个受Wig - 1结合且调控的mRNA，其中多数在Wig - 1敲低后表达上调，说明Wig - 1主要起mRNA去稳定作用。此外，还验证了部分Wig - 1结合mRNA，分析了其3′UTR的序列和二级结构，发现Wig - 1优先结合含AREs和/或富含AU的mRNA，并鉴定出HIF1A mRNA中与Wig - 1结合的2D结构基序，为理解Wig - 1在细胞周期、增殖及肿瘤发生中的作用提供了依据。

  • 细胞样品

    确认细胞生长状态良好，对细胞进行准确计数，细胞量 >3x10^7个；

    每个样本准备3~4管，具体细节详询销售

     

     

    动物组织

    应当大于200mg，且组织新鲜；取材后用生理盐水进行漂洗，去除血渍和污物，剔除结缔组织等

     

     

    植物组织

    选取取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，需制备成原生质体。建议样品制备 2~3 份。