研究蛋白质与DNA互作的全新利器
CUT&Tag
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CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag)是一种研究蛋白质与DNA互作的新方法。该方法通过分子生物学手段将高活性的Tn5转座酶与Protein A融合,并装载建库接头引物形成pA-Tn5转座复合物。在抗体的引导下该pA-Tn5转座复合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。
与传统ChIP-Seq相比,该技术无需交联与超声打断操作,规避了抗原决定簇遮盖和样本损失问题,提高了信噪比,所需细胞量减少(可低至60个)。与CUT&Run相比,该技术在pA-Tn5转座复合物进行切割时在切割片段的两端加上接头序列,可直接PCR建库,无需末端抹平和接头连接的操作,省时高效。
CUT&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端,应用于临床和科研的表观遗传学研究。或是结合生物信息学分析,找到转录因子下游调控的靶基因,为进一步阐明生物学机制提供依据。
CUT&Tag
相比于ChIP-Seq,CUT&Tag具有很多独特的优势:
1、原位激活转座酶(Tn5)酶切分辨率高,背景信号低;
2、无需交联,不受ChIP中甲醛交联引起的表位掩盖的影响;
3、无需超声,简化了操作流程,节约实验时间;
4、转座体产生的片段自带测序接头,用于PCR富集,无需额外的建库步骤;
5、高灵敏度,可重复性好,所需细胞起始量低(60<cells<100000)。
该研究选择棉花为实验材料,以H3K4me1组蛋白修饰为例,结果表明,CUT&Tag方法比ChIP-Seq的实验流程更快,分辨率更高,背景信号更低、重复性更好。
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2023年3月1日,中国科学院上海营养与健康研究所丁秋蓉研究组在Molecular Cell杂志在线发表了题为“Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting”的研究论文。该研究发现了组蛋白H3S28磷酸化(H3S28ph)响应饥饿情况下胰高血糖素信号,直接调控肝脏糖异生基因转录激活的生物学机制:在饥饿状态下,胰高血糖素激活PKA信号通路,PKA继而被CREB招募到基因组糖异生基因调控区域,磷酸化H3S28。磷酸化的H3S28ph被14-3-3ζ识别,招募更多的RNA聚合酶II(Pol II),激活糖异生基因转录。并发现进食状态下,PP2A作为H3S28ph的磷酸酶抑制其磷酸化,继而抑制糖异生基因的表达。该研究发现了组蛋白磷酸化在肝脏糖稳态调控中的生物学功能,并发现了CREB作为桥梁蛋白介导PKA磷酸化H3S28继而调控糖异生基因转录的调控模式。