•        CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）是一种研究蛋白质与DNA互作的新方法。该方法通过分子生物学手段将高活性的Tn5转座酶与Protein A融合，并装载建库接头引物形成pA-Tn5转座复合物。在抗体的引导下该pA-Tn5转座复合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。

    与传统ChIP-Seq相比，该技术无需交联与超声打断操作，规避了抗原决定簇遮盖和样本损失问题，提高了信噪比，所需细胞量减少（可低至60个）。与CUT&Run相比，该技术在pA-Tn5转座复合物进行切割时在切割片段的两端加上接头序列，可直接PCR建库，无需末端抹平和接头连接的操作，省时高效。

    CUT&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端，应用于临床和科研的表观遗传学研究。或是结合生物信息学分析，找到转录因子下游调控的靶基因，为进一步阐明生物学机制提供依据。

    CUT&Tag

    相比于ChIP-Seq，CUT&Tag具有很多独特的优势：

    1、原位激活转座酶（Tn5）酶切分辨率高，背景信号低；

    2、无需交联，不受ChIP中甲醛交联引起的表位掩盖的影响；

    3、无需超声，简化了操作流程，节约实验时间；

    4、转座体产生的片段自带测序接头，用于PCR富集，无需额外的建库步骤；

    5、高灵敏度，可重复性好，所需细胞起始量低（60<cells<100000）。

     

    该研究选择棉花为实验材料，以H3K4me1组蛋白修饰为例，结果表明，CUT＆Tag方法比ChIP-Seq的实验流程更快，分辨率更高，背景信号更低、重复性更好。

  • 对于CUT&Tag数据分析，首先利用fastqc软件对原始数据进行质量评估；再使用BWA或bowtie软件将原始数据比对到参考基因组；然后用MACS分别对每例样本进行峰挖掘（peak calling），之后对 peaks 区域进行基因组位置注释、motif分析，并对靶基因进行GO和KEGG富集分析；若具有多种实验组样本，可挖掘各组样本间具有差异的peaks进行特异性分析等。

    分析流程

    关于CUT&Tag的文库构建，主要分为以下几步：

    1、富集细胞进行裂解，提取纯化细胞核；

    2、分别孵育一抗和二抗；

    3、pA/G-Tn5酶孵育；

    4、激活转座子，进行DNA片段化;

    5、纯化片段化后的DNA；

    6、扩增纯化产物；

    7、分选扩增后的DNA长度，去除非目的片段。

    文库构建

  • 2023年3月1日，中国科学院上海营养与健康研究所丁秋蓉研究组在Molecular Cell杂志在线发表了题为“Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting”的研究论文。该研究发现了组蛋白H3S28磷酸化（H3S28ph）响应饥饿情况下胰高血糖素信号，直接调控肝脏糖异生基因转录激活的生物学机制：在饥饿状态下，胰高血糖素激活PKA信号通路，PKA继而被CREB招募到基因组糖异生基因调控区域，磷酸化H3S28。磷酸化的H3S28ph被14-3-3ζ识别，招募更多的RNA聚合酶II（Pol II），激活糖异生基因转录。并发现进食状态下，PP2A作为H3S28ph的磷酸酶抑制其磷酸化，继而抑制糖异生基因的表达。该研究发现了组蛋白磷酸化在肝脏糖稳态调控中的生物学功能，并发现了CREB作为桥梁蛋白介导PKA磷酸化H3S28继而调控糖异生基因转录的调控模式。

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  • 细胞样品

    单次ATAC-seq反应所需细胞应当严格控制在100,000个/管（每个样本准备3~4管），具体细节详询销售。

     

     

    动物组织

    选取新鲜组织，质量大于30mg/份，取样时剔除冗余部分，保证组织的单一性，建议取材后用生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

     

     

    植物组织

    选取取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，质量大于500mg/份，建议取样后用清水漂洗去除污物，纸巾吸干水分后液氮速冻，-80℃保存。建议样品制备 2~3 份。

    具体细节，详询销售或技术人员。