环状DNA是自然界中普遍存在的一种DNA分子形式，如，细菌基因组DNA、质粒、线粒体DNA等。在真核生物中还有一类特殊的环状DNA分子，它们是从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外，以特殊的方式参与生理或病理过程。鉴于它们是独立于染色质之外的DNA分子，便统称为染色体外DNA（ecDNA），由于多是环状形式，因此统称为染色质外环状DNA（eccDNA）,目前研究eccDNA强有力的方式之一是Circle-seq技术。

达澈小讲堂

01-Circle-seq

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）是一种研究蛋白质与DNA互作的新方法。该方法通过分子生物学手段将高活性的Tn5转座酶与Protein A融合，并装载建库接头引物形成pA-Tn5转座复合物。在抗体的引导下该pA-Tn5转座复合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。

达澈小讲堂

04-CUT&Tag

达澈小讲堂

02-RIC-seq

RNA结构在基因表达调控的过程中扮演着重要角色，在细胞内，绝大多数RNA通过分子内的碱基配对可形成二级结构，并在RNA结合蛋白（RBP）的介导下折叠成复杂的三级结构，高度结构化的RNA通过与其他RNA分子相互作用以发挥生物学调控功能，因此解析细胞内RNA的原位高级结构及作用靶标是研究其功能机制的关键。

ATAC-seq技术，全称为：Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing），是2013年由斯坦福大学William J. Greenleaf和Howard Y. Chang实验室开发的一种用于研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法。

达澈小讲堂

03-ATAC-seq

染色质免疫共沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-seq）是用于研究蛋白质与DNA相互作用的方法。该技术将染色质免疫沉淀（ChIP）与NGS相结合，以鉴定DNA与相关蛋白结合的部位，可对目标蛋白在全基因组上的结合位点进行精确定位。在活细胞内固定DNA与蛋白结合的复合体，然后用蛋白特异性的抗体，通过抗原抗体特异性结合的免疫学手段捕获该复合体，然后洗脱蛋白质，得到与目的蛋白结合的DNA片段，将富集到的DNA片段进行上机测序。和依托芯片的Chip-chip技术相比，ChIP-seq实验周期短且高效，覆盖的基因组范围也更加广泛。测序成本的降低让ChIP-seq成为表观研究的利器之一。

达澈小讲堂

05-ChIP-seq

CUT&Tag技术与传统ChIP-Seq相比，该技术无需交联与超声打断操作，规避了抗原决定簇遮盖和样本损失问题，提高了信噪比，所需细胞量减少（可低至60个）。与CUT&Run相比，该技术在pA-Tn5转座复合物进行切割时在切割片段的两端加上接头序列，可直接PCR建库，无需末端抹平和接头连接的操作，省时高效。CUT&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端，应用于临床和科研的表观遗传学研究。或是结合生物信息学分析，找到转录因子下游调控的靶基因，为进一步阐明生物学机制提供依据。

达澈小讲堂

06-ChIP-seq，CUT&Tag

RNA修饰是指发生在RNA分子上的各种化学修饰（已超160种），每种修饰都有相应的功能，如：稳定结构、出核运输、可变剪接、翻译识别等。其中甲基化修饰是主要形式之一，约占2/3，RNA的甲基化修饰多位于mRNA、tRNA、rRNA和其他非编码RNA上。

随着NGS的广泛应用，RNA修饰得到了广泛研究，已是表观遗传领域的热点。

达澈小讲堂

07-RNA修饰类测序

经典中心法则指出DNA转录产生mRNA，而mRNA指导蛋白质的合成，蛋白质是生命活动的主要承担者。然而科学家们发现人类基因组中70%以上的DNA可以转录产生RNA，而具有编码蛋白能力的mRNA只占3%左右，说明多数转录的RNA分子都属于非编码RNA，对于RNA的翻译主要分为：不翻译，部分翻译，从头翻译，过度翻译。随着NGS的广泛应用，翻译组学研究迅速成为现代生命科学的热点之一，其中，核糖体印迹测序技术是该研究的利器之一（Ribosome profiling，Ribo-seq），该技术由Weissman课题组于2009年发表在Science杂志上。此后相继应用到微生物、酵母、小鼠、人类组织、玉米、拟南芥、斑马鱼等多个物种研究上。

达澈小讲堂

08-Ribo-seq

达澈小讲堂

09-CLIP-seq、RIP-seq

RNA和RBP的相互作用扮演者重要的生物学功能,随着NGS的兴起该研究领域迅速火热起来。