•        RNA修饰是指发生在RNA分子上的各种化学修饰（已超160种），每种修饰都有相应的功能，如：稳定结构、出核运输、可变剪接、翻译识别等。 ac4C（N4-acetylcytidine，N4位乙酰胞嘧啶）是一种真核原生生物保守的化学修饰。首次发现于细菌tRNA met的反密码子第一位，其存在保证了翻译过程的准确性，近期研究显示mRNA上也存在大量的ac4C。该修饰可以促进蛋白翻译，影响RNA的稳定性与可变剪切，调控基因表达。 随着NGS的广泛应用，RNA修饰得到了广泛研究，已是表观遗传领域的热点，而acRIP-seq则是研究ac4C修饰强有力的技术之一，该技术基于抗体特异性结合乙酰化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集乙酰化修饰片段为基础，通过高通量测序在全转录范围内研究乙酰化的RNA区域，同时，需要设计Input对照样（类似与ChIP-seq）消除背景(Arango et al., 2018)。

     

    ac4c-meRIP-seq

  • 获得测序数据后，通过以下流程进行分析：

    1.使用fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2.使用STAR软件将Clean Data比对到参考基因组；

    3.采用samtools对sam文件进行处理，整理排序并去除重复序列；

    4.使用MACS2进行Peak calling，寻找测序读段高覆盖峰；

    5.使用bedtools对覆盖峰进行注释，使用HOMER完成motif分析；

    6.借助R相关包实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。

    分析流程

    acRIP-seq的文库构建主要分为以下几步：

    1.提取总RNA，使用DNase I，去除DNA污染； 2.沉淀RNA，乙醇洗涤，将产物置于无酶水中； 3.测RNA浓度；

    4.热循环仪中孵育将RNA片段化；

    5.评估RNA片段化大小（200nt左右）；

    6.加入抗ac4C抗体孵育；

    7.洗脱富集RNA，反转录；

    8.构建cDNA文库；

    9.上机测序。

    文库构建

  •     《Targeting N4-acetylcytidine suppresses hepatocellular carcinoma progression by repressing eEF2-mediated HMGB2 mRNA translation》发表于Cancer Communications。研究团队来自华中科技大学同济医学院附属同济医院等多个机构。本研究聚焦于 N4 - 乙酰胞苷（ac4C）这种新型 mRNA 修饰在肝细胞癌（HCC）中的作用。研究发现 HCC 中 ac4C RNA 水平和 N - 乙酰转移酶 10（NAT10）表达显著增加，且 NAT10 高表达与患者不良预后相关。机制上，NAT10 促进 ac4C 修饰，增强真核延伸因子 2（eEF2）与 HMGB2 mRNA 结合，提升 HMGB2 翻译，推动肿瘤进展。此外，研究筛选出 Panobinostat 可有效抑制 NAT10 介导的 ac4C 修饰，在体内外均展现出良好的抗 HCC 效果。该研究为 HCC 的诊疗提供了新的潜在靶点和治疗策略 。

           主要探究了 NAT10 对 ac4C mRNA 修饰和整体 mRNA 翻译的影响。通过 acRIP-seq 分析，在对照组 MHCC-97H 细胞中鉴定出 11,591 个 ac4C 峰，涉及 4,784 个修饰转录本，NAT10 缺陷型细胞则有 3,148 个峰和 691 个修饰转录本，有 9,052 个峰在敲低细胞中消失。检测到的峰富集 “CXX” 基序，且 ac4C 在不同 RNA 区域的分布模式在两组相似。

  • RNA样品

    Total RNA: ≥300ug，RIN值要＞7.5

     

     

     

    细胞或者组织

    细胞量 ≥30million

     

    动物组织量 ≥500mg，植物组织量 ≥5g

     

    建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。

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