• RNA修饰是指发生在RNA分子上的各种化学修饰（已超160种），每种修饰都有相应的功能，如：稳定结构、出核运输、可变剪接、翻译识别等。其中甲基化修饰是主要形式之一，约占2/3，RNA的甲基化修饰多位于mRNA、tRNA、rRNA和其他非编码RNA上。其中m7G修饰（N7-methyladenosine），是一种自带正电荷的RNA甲基化修饰，在甲基化转移酶的作用下，使RNA鸟嘌呤（G）的第七位氮原子加上甲基的一种化学修饰。m7G RNA甲基化修饰常存在于真核生物mRNA 5’帽子结构，具有调控mRNA的转运，翻译，剪切过程，除了存在于5’帽子结构外，m7G也存在于tRNA和rRNA序列内部，随着NGS的广泛应用，RNA修饰得到了广泛研究，已是表观遗传领域的热点，而MeRIP-seq则是研究m7G修饰强有力的技术之一。

    MeRIP-seq是将MeDIP、RIP及RNA-seq技术结合起来，在全基因组范围内精确检测RNA甲基化，对RNA样品进行片段化，利用特异性的RNA甲基化抗体进行免疫共沉淀反应，将获得的甲基化修饰片段测序。同时，需要设计Input对照样（类似与ChIP-seq）消除背景。

     

    m7G-meRIP-seq

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  • 对于获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1、Fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、用BWA软件将Clean Data比对到参考基因组；

    3、Samtools对sam文件进行处理，整理排序并去除重复序列；

    4、MACS2进行Peak calling (q = 0.01)，寻找测序读段高覆盖峰；

    5、Deeptools对覆盖峰进行注释，并完成motif分析；

    6、借助R语言实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。

    分析流程

    构建meRIP-seq文库，主要分为以下几步：

    1、提取总RNA，使用DNase I，去除DNA污染

    2、沉淀RNA，乙醇洗涤，将产物置于超纯水中

    3、测RNA浓度，热循环仪中孵育将RNA片段化

    4、评估RNA片段化大小（200nt左右）

    5、加入抗m7G抗体孵育

    6、洗脱富集RNA

    7、构建cDNA文库

    8、上机测序

    文库构建

  • 2019年6月，《Molecular Cell》刊发了剑桥大学戈登研究所和病理学系Tony Kouzarides团队的研究成果，他们开发了两个不同但互补的深度测序方法，用于研究miRAN上m7G修饰，证明METTL1甲基化了某些特异肿瘤抑制因子的miRNA，包括let-7，促进它们从初级转录本到前体的加工过程，METTL1的缺失导致其基因表达和表型改变，m7G修饰的miRNA有形成G-quadruplexes结构的倾向，从而影响了前体miRNA的形成。

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    通过特异性抗体和化学特性结合的高通量测序方法，发现很多RNA修饰存在与tRNA和rRNA之外的其他RNA分子中，如7-甲基鸟苷(m7G)，利用其修饰的化学特性进行高精度研究，其中METTL1(methyltransferase-like 1)的研究最深入，通过与WDR4共同介导某些tRNA（如 tRNA-Phe）G46位点上的m7G修饰。相对于DNA上的7-mG修饰，RAN上的m7G修饰更加稳定，此类修饰可以显著改变RNA的电荷密度，很可能影响RNA的二级结构，但并不影响碱基配对，所以RNAs上的m7G不会干扰逆转录，导致基于序列的技术检测无法检测到该修饰。

     

    METTL1通过对let-7e上G11位点进行m7G修饰，来影响此位点的G-四联体茎环结构稳定性，从而促进let-7e从pri-miRNA到per-miRNA的加工过程，最终促使miRNA成熟，而成熟的let-7e通过结合到下游基因HMGA2，来实现抑制细胞迁移的功能。

  • RNA样品

    Total RNA: ≥300ug，RIN值要＞7.5

     

     

     

    细胞或者组织

    细胞量 ≥30million

     

    动物组织量 ≥500mg，植物组织量 ≥5g

     

    建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。