高通量单细胞染色质易开放区域测序服务
scATAC-seq
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多数基因组中的染色质都紧紧盘绕在细胞核内,但也有一些区域经染色质重塑后呈现出松散的状态,这部分无核小体的裸露DNA区域被称为开放染色质(open chromatin),而DNA复制和基因转录都发生在这些区域。染色质的这种特性叫做染色质的易接近性(chromatin accessibility),通过研究细胞特定状态下开放的染色质区域可以在DNA水平上了解其转录调控。
10x scATAC-seq的核心是捕捉个别细胞的染色质可及性信息。它是大规模 ATAC-seq 的单细胞变体,现在是研究组织表观遗传特征的最流行方法之一。 10x scATAC-seq基于GemCode微流体平台,利用Tn5转座酶切割染色质的开放区域,并加上测序引物进行高通量测序,以高分辨率研究染色质开放区域,为成千上万个单细胞提供全面的染色质调控图谱。
scATAC-seq
产品优势
哪些类型的样本与 scATAC-seq 兼容?
scATAC-seq 与任何具有参考基因组的常见生物的样本兼容,包括冷冻保存的细胞或速冻组织。如果您对不寻常的样本类型感兴趣,或者遇到裂解挑战,我们的研发部门可以帮助您定制适合您需求的方法。scATAC-seq 的样本要求与 10x Genomics 单细胞基因表达的样本要求相同,可在此处找到。
ATAC-seq 与其他表观遗传方法相比如何?
单细胞 ATAC-seq 中使用的 Tn5 转座酶可捕获所有开放的染色质区域。而 ChIP-seq 和其他方法使用受特定因子结合的染色质区域。将两者进行比较,scATAC-seq 提供了一种无偏的全基因组方法。尽管如此,具有已知结合基序的转录因子在 scATAC-seq 数据中是可识别的。
scATAC-seq 相对于bulk ATAC-seq 有哪些优势?
scATAC-seq 相对于bulk ATAC-seq 具有以下优势: 1.将平均信号转换为单细胞分辨率,以准确识别组织中的所有细胞类型并表征异质组织动态。 2.描述细胞类型或谱系特异性调控元件。 3.更高精度的细胞状态识别对于生成发育轨迹、细胞分化和疾病相关的细胞状态变化至关重要。 4.检测小细胞群或过渡状态中不常见的染色质可及性事件。 跟踪动态变化的准确性更高,例如时间过程实验。
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1、通过试剂盒从新鲜和冷冻保存的细胞、新鲜组织以及迅速冷冻的组织中获得高质量的细胞核悬液。
2、分离的细胞核通过加入 Tn5 转座酶蛋白进行大规模标记化。
3、基于微流体技术,为每个已标记化的 DNA 片段添加一个细胞特异性的条形码。
4、经过扩增的条形码测序索引可以使用下一代测序技术进行测序。
5、利用专门的算法,比如10x Genomics的CellRanger和MACS2进行数据分析。
技术流程
分析流程
构建完成的文库如左图所示,从左到右(5'~3')分别是:Illumina P5接头、P5测序引物、16bp 10x™Barcode、插入DNA片段、P7测序引物、样本Index(i7 index read)、Illumina P7接头。Read 1和Read 2用来对插入片段进行测序。
结果解释
scATAC-seq工作流程以单细胞分辨率生成染色质可及性图谱,从中可以获得以下见解:
1、编码区的峰值表示转录机制的可及性,因此这些基因可能在这个细胞中被表达或准备表达。
2、非编码区的峰值表示调控蛋白的可及性,例如转录因子。因此,这些区域可能是活跃的调控元件。
3、非编码区与编码区之间的相关性表明调控蛋白与基因之间的相互作用。非编码区可能是相关基因的顺式调控元件,即调控蛋白结合的区域,影响邻近基因的表达。
4、不同非编码区中反复出现的结合基序可以暗示哪些调控蛋白在细胞中活跃。
5、基于10x单细胞ATAC数据的细胞聚类生成细胞簇,您可以为这些细胞簇分配细胞类型和亚型名称。选择最相关的峰值可以帮助您定义聚类。您可以将其与通过单细胞RNA-seq中最可变基因定义聚类进行比较。
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"Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion":发表在 2019 年的《Nature Biotechnology》上。这篇文章由 ATAC-seq 的发明者所在的实验室使用 10x Genomics 公司开发的 sc-ATAC-seq 技术分析得出,对于理解该技术在免疫细胞研究中的应用具有重要意义,其数据编号为 GSE129785。该研究不仅发现了人类造血过程中重要的顺式和反式调控元件,绘制疾病相关增强子活性的图谱,重建从祖细胞分化为多种罕见免疫细胞类型的轨迹。阐述了基底细胞癌中,肿瘤微环境中恶性、间质和免疫细胞类型的调控结构,揭示了T细胞衰竭机制。为染色质可及性的应用研究提供了理论指导。
研究结果:
■ 对骨髓和血液的单细胞ATAC数据进行染色质可及性分析,绘制出B细胞发育轨迹。利用拟时间序列分析来识别血浆B细胞分化过程中顺式元件和反式调节因子的阶段特异性活动。发现B细胞发育的每个阶段都存在特定的动态调控元件。
■ 对PD-1阻断治疗前后基底癌患者的37,818个细胞进行单细胞ATAC测序,发现肿瘤细胞群表现出患者特异性,反映了由患者特异性基因组改变驱动的细胞状态变化。推测与肿瘤发生相关的重要调节因子在免疫细胞中存在不同的激活调控机制。
■ 对23,274个T细胞进行重新分群,T细胞衰竭伴随着染色质可及性的全局重构,这种细胞状态所占据的表观遗传状态与大多数其他公认的T细胞状态一样明显。拟时间序列结果显示调控元件在不同亚群中的表现揭示了T细胞衰竭机制。
该研究首先从分离自各种小鼠和人类组织的造血免疫细胞中生成转座酶可及染色质测序(scATAC-seq)数据集的单细胞分析。这一全面的图谱揭示了免疫细胞的全局染色质可及性模式,从而可以详细检查其基因调控网络。作者确定了不同免疫细胞类型的不同染色质可及性特征,证明这些特征受细胞类型的影响比对来源组织的影响更大。
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新鲜组织样品
1、组织保存液,标准为5 mL/样品。组织块大小≥8 mm3 或40 mg。收到的组织保存液暂时不使用的情况下,存放在4℃ 冰箱。
2、建议取材后用生理盐水漂洗,以去除血渍和污物,建议样品制备 1~2 份,4℃运输。
冰冻动物组织
1、组织质量 > 100mg,并且组织新鲜,提核的动物组织样本可以采用液氨速冻,干冰运输的方式。
2、样本使用预冷的PBS冲洗干净表面的血和筋膜,用吸水纸或者纱布将表面吸干。
3、注意操作迅速,全程在冰上操作。将组织放入冻存管中, 迅速浸入液氮中速冻2 min以上,然后放入液氮中长期保存。
4、冻存管做好样本信息标记。为了确保实验顺利,建议样本备份1-2份,干冰运输。
全血、骨髓血、贴壁或悬浮培养的细胞等样品类型
1、全血或骨髓血样品放在 EDTA 抗凝管(紫帽)中保存,样品量不少于 3ml, 充分混匀后运输。贴壁或者悬浮培养的细胞,总细胞量不少于5 x 105。
2、运输过程中注意做好缓冲保护。把抗凝管或者细胞培养瓶放在密封袋中。用运输缓冲包装(气柱袋一类的)包起来,放进泡沫箱中。
3、尽量将样本固定牢靠,避免样本来回摇晃或者剧烈震荡,造成细胞破裂.常温运输(4-18℃)。
具体送样细节,请咨询销售。
靶向DNA切割原理
具体送样细节,请咨询销售。