转录组测序利器
CircRNA-seq
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环状RNA(circRNA)是一类由特殊剪接机制形成的、具有闭合环状结构、大量存在于真核转录组中的非编码RNA。CircRNA分子具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征,使得circRNA作为临床疾病的biomarker具有明显的优势。
目前研究发现circRNA主要有3个功能:充当miRNA“海绵”、调节转录和剪接、与RNA结合蛋白相互作用。尤其是在不同物种能竞争性结合miRNA,从而解除这些miRNA对其他靶标的调控。而与疾病关联性miRNA的相互作用说明环状RNA对疾病的调控起着非常重要的作用。此外,一些内含子类型的环状RNA(ciRNA)会促进宿主基因的转录。
CircRNA目前是生命科学和医学领域研究的热点分子。
CircRNA-seq
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cirrna-seq(Circular RNA sequencing)实验流程主要包括以下几个关键步骤:
1. RNA提取与纯化 组织或细胞样本处理:使用Trizol溶液处理组织或细胞样本,如组织样品用电动组织匀浆器冰上匀浆,细胞样品则去除上清后加入Trizol溶液裂解。 RNA提取:使用氯仿抽提、异丙醇沉淀和75%乙醇洗涤的方法,纯化总RNA。
2. 去除核糖体RNA和Poly(A)RNA 使用核糖体RNA去除试剂盒或通过氯仿抽提部分去除核糖体RNA。 使用聚(A)结合磁珠去除Poly(A)RNA。
3. RNAse R消化 RNAse R处理:使用RNAse R消化部分线性RNA,留下circRNA。 RT-PCR检测:消化后进行逆转录PCR,以检测circRNA的存在。
4. circRNA的富集与纯化 使用例如RNA亲和沉淀或免疫沉淀的方法,进一步富集circRNA。
5. 建库与测序 RNA-seq建库:将纯化的circRNA进行cDNA合成和测序库构建。 高通量测序:使用如NovaSeq 6000等测序平台进行双端测序。
6. 数据分析 数据质量控制:对测序数据进行检查,去除低质量的读段。 circRNA鉴定:使用生物信息学工具识别circular RNA,并进行定量分析。 7. 实验验证 PCR验证:使用特异性引物进行PCR验证circRNA的序列。 Northen Blot:使用Northern Blot对circRNA的完整性和表达丰度进行验证。
文库构建
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2017年6月,《Molecular Therapy》刊发了北京师范大学张文生教授团队的研究成果。该研究利用RNA-seq技术,对7月龄的快速老化模型 小鼠8(SAMP8)的脑组织进行基于circRNA的ceRNA作用网络的系统分析。
研究结果表明,两组小鼠间存在有235个发生显著差异的 circRNA转录本(其中94个发生上调和141个发生下 调)。基于TPM分析,检测到两个组之间有30个发生显著 差异的miRNA,其中在SAMP8小鼠中有12个表达上调的miRNAs,在SAMP1小鼠中有18个表达上调的miRNAs。 最后利用FPKM鉴定出SAMP8小鼠中1,202个发 生显著差异的mRNA转录本,其中有716个转录本上调表 达,486个下调表达。
利用研究中的RNA-seq数据,首次对SAMP8小鼠大脑中的一个 ceRNA网络进行了鉴定。选择了235个circRNA和1202个差异表达的mRNA,及MRE的常见结合位点(30个显著差异的miRNA)。
结果显示,ceRNA网络覆盖了两种情况 : 一种是circRNA(在SAMP8小鼠中上调)-miRNA(在SAMP8小 鼠中下调)-mRNA(在SAMP8小鼠中上调)的调控网络,另一 种是circRNA(在SAMP8小鼠中下调)-miRNA(在SAMP8小鼠 中上调)-mRNA(在SAMP8小鼠中下调)的调控网络。