• RNA修饰是指发生在RNA分子上的各种化学修饰（已超160种），每种修饰都有相应的功能，如：稳定结构、出核运输、可变剪接、翻译识别等。其中甲基化修饰是主要形式之一，约占2/3，RNA的甲基化修饰多位于mRNA、tRNA、rRNA和其他非编码RNA上。其中m6A修饰（N6-methyladenosine），是指在RNA腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰，修饰位点附近序列高度保守，随着NGS的广泛应用，RNA修饰得到了广泛研究，已是表观遗传领域的热点，而MeRIP-seq则是研究m6A修饰强有力的技术之一。

    MeRIP-seq是将MeDIP、RIP及RNA-seq技术结合起来，在全基因组范围内精确检测RNA甲基化，对RNA样品进行片段化，利用特异性的RNA甲基化抗体进行免疫共沉淀反应，将获得的甲基化修饰片段测序。同时，需要设计Input对照样（类似与ChIP-seq）消除背景。

    m6A-meRIP-seq

  • 对于获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1、Fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、用BWA软件将Clean Data比对到参考基因组；

    3、Samtools对sam文件进行处理，整理排序并去除重复序列；

    4、MACS2进行Peak calling (q = 0.01)，寻找测序读段高覆盖峰；

    5、Deeptools对覆盖峰进行注释，并完成motif分析；

    6、借助R语言实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。

    分析流程

    构建meRIP-seq文库，主要分为以下几步：

    1、提取总RNA，使用DNase I，去除DNA污染；

    2、沉淀RNA，乙醇洗涤，将产物置于超纯水中；

    3、测RNA浓度，热循环仪中孵育将RNA片段化；

    4、评估RNA片段化大小（200nt左右）；

    5、加入抗m6A抗体孵育；

    6、洗脱富集RNA；

    7、构建cDNA文库；

    8、上机测序。

    文库构建

  • 2016年，《Cancer Cell》杂志刊发了陈建军、何川课题组共同完成的研究成果，文章报道了FTO作为6甲基腺苷脱甲基酶（m6A demethylase），在急性髓白血病（AML）中扮演着重要角色。FTO在多种AML（染色体重排、突变等）中高表达，其通过降低mRNA转录本的m6A修饰水平来调节ASB2，RARA等靶基因的表达，可以促进由白血病原癌基因介导的细胞转化、白血病发展，并且抑制全反式维甲酸(ATRA)诱导的AML细胞分化，证明了m6A甲基化和相应蛋白在癌症中的功能重要性，并为白血病的发生和药物反应提供了指导性见解。

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    在本研究中，证明了FTO，一个肥胖风险相关基因和第一个被发现的m6A橡皮擦，在造血细胞转化和白血病发生中起着关键的致癌作用。简言之，FTO表达可由某些致癌蛋白质（例如，MLL融合蛋白、PML-RARA、FLT3-ITD和NPM1突变体）上调，因此FTO在AML的某些亚型中异常上调，例如t（11q23）/MLL重排、t（15；17）、FLT3-ITD和/或NPM1突变的AML。

  • RNA样品

    （常量）: Total RNA: ≥300ug，RIN值要＞7.5；

    （微量）: Total RNA: ≥30ug，RIN值要＞7.5；(rRNA去除方式建库)。

     

    细胞或者组织

    细胞量 ≥30million（常量）；

    细胞量≥10million（微量）；

    动物组织量 ≥500mg；植物组织量 ≥5g；建议样品制备 2~3 份，具体细节详询销售。