•      免疫系统是由各种细胞类型组成的复杂的网络,各种免疫细胞类型之间以及与组织实质细胞之间相互作用,在疾病发病机制中发挥核心作用,介导了免疫过程。T/B 细胞是特异性免疫系统的两大主体细胞群,其如何发挥作用一直是免疫学研究的核心问题。TCR/BCR分子中的高可变区由V、D、J基因组合编码,通过模块化排列组合和突变等高度基因重排的形式产生多种多样的TCR/BCR。以BCR为例,在人类的基因中,大约有40种不同的V模块,25种不同的D模块以及6种不同的J模块。B细胞分别从V、D、J、C基因模块中选取一个拼接在一起,组装成一个成熟BCR编码基因,将有40*25*6=2400种组合。

        scRNA由于只能获取转录本基因表达层面信息,还是不足以详细的刻画出组织内的免疫微环境。 scV(D)J利用独特建库方式,对样本进行转录组测序的同时,也可对T细胞与B细胞进行V(D)J区域测序,获得同一个细胞的基因表达信息与V(D)J序列信息,通过TCR/BCR的功能信息补充基因表达谱,从而更详细地了解不同T/B细胞群的行为,更加全面的方式了解免疫微环境的复杂性和多样性。

    scV(D)J-seq

        高通量单细胞V(D)J测序技术能够在单细胞层面上,一次完成成千上万个单细胞的mRNA捕获,在获得每个细胞的全基因表达谱的同时,获得每个T淋巴细胞和B淋巴细胞的V(D)J基因表达信息。为满足“高通量”和“单细胞”的需求,高通量单细胞V(D)J测序主要借用液滴微流控芯片和带有分子标签的微球来实现。在液滴微流控芯片的加样孔中加入样本解离后得到的单细胞悬液,带有分子标签的微球,反转录试剂盒,以及液滴生成油。

        每个加样孔底端存在微流控流道,通过控制微球、细胞、试剂等在微流控流道中的流速,能让微球、细胞、试剂按照预期比例完成配对,最后通过水相进入油相,能将细胞和微球封闭于油包水中,以此形成单细胞状态。

  • 靶向DNA切割原理

    高通量单细胞V(D)J测序同样需先将组织样本解离到单细胞悬液状态,然后借助微流控芯片形成油包水结构完成单细胞分离,随后进行核酸捕获和转录组文库和TCR/BCR文库构建。具体流程如下图:

     

    1、细胞标签提取与纠错

    2、测序数据质控

    3、参考基因组对比

    4、基因定量

    5、生成表达矩阵

    6、生成可视化报告

     

    分析流程

    技术流程

     

    1、在油包水结构中,细胞膜溶解释放出细胞内mRNA分子

    2、mRNA分子在逆转录酶作用下合成单链cDNA,通过带有细胞标签(Cell Barcode)的寡核苷酸捕获cDNA分子,并进一步合成双链DNA分子。在此过程中,每个DNA分子都被打上了细胞标签

    3、取其中部分双链cDNA分子,完成全基因表达谱转录组文库构建并测序

    4、取其中部分双链cDNA分子,通过结合V(D)J基因保守区域的引物,完成V(D)J文库构建并测序

  •    2022年10月22日,研究人员在Cell Discovery(IF=38)在线发表题为“Cellular basis of enhanced humoral immunity to SARS-CoV-2 upon homologous or heterologous booster vaccination analyzed by single-cell immune profiling”的研究论文,该研究表明单细胞免疫分析同源或异源加强疫苗接种增强SARS-CoV-2体液免疫的细胞基础。该研究对同源BBIBP-CorV/BBIBP-CorV或异源BBIBP-CorV/ZF2001方案的受体进行了6个月以上的增强剂量免疫后抗体应答的持久性和单细胞免疫谱进行了纵向研究。两种强化方案都显著提高了中和抗体的产生,抗体可以持续至少6个月。

     

         大量单细胞5 ' mRNA和V(D)J测序(scRNA/V(D)J-seq)可以在单细胞分辨率下提供细胞异质性和免疫库多样性的景观视图。在此之前,这种方法已被用于BNT162b2疫苗诱导的抗原特异性CD8 T细胞应答。scRNA-seq和scV(D)J-seq共同有助于了解B和T细胞的克隆性、疫苗诱导的细胞表型和转录特征,对COVID-19的干预有很大的帮助。

           通过高通量单细胞V(D)J测序技术可以了解到每份样本中不同细胞占比,以及每个细胞基因表达情况。单细胞分析揭示同源和异种增强剂诱导的早期和长期体液免疫的潜在机制,作者发现BBIBP-CorV/ZF2001异种加强针组和BBIBP-CorV同源加强针组均能唤起功能性B细胞应答,诱导naïve B细胞重新活化,并激活IgA和IgG浆细胞及其同型分化。研究结果表明,与同源加强针相比,异源加强针可以更早、更强地诱导抗原特异性免疫应答,这可能与两种疫苗的生产策略不同有关。

        后续的数据分析阶段,基于细胞标签可将转录组文库和V(D)J文库还原到单细胞水平,用于了解每个细胞的基因表达谱和V(D)J基因表达信息。通过每个细胞的全基因表达谱,结合不同类型细胞特定表达的Marker基因,可对每个细胞进行细胞注释,了解每个样本中存在那些类型的细胞,每种细胞的数量,以及每个细胞的基因表达情况。结合V(D)J文库可了解到每个T淋巴细胞或B淋巴细胞的表达了何种V(D)J基因,对应何种TCR/BCR分子。

  •  

     

     

    新鲜组织样品

    1、人/小鼠,目标组织切取量≥0.4g;穿刺样本:人/小鼠,粗针进行采集,不少于3针

    2、建议样品制备 1~2 份,组织保存液保存。4℃运输,48小时内送至实验室。

     

     

    新鲜细胞样品

    1、细胞量≥60万,通过镜检观察,判断细胞状态良好。

    2、建议样品制备 1~2 份,4℃运输,48小时内送至实验室。

     

     

     

     

    全血等样品

    1、全血≥5ml。

    2、运送介质:全血碎冰运输、冰袋运送(注意温度勿过低导致血液冻结)。建议样品制备 1~2 份。4℃运输,48小时内送至实验室。

     

     

     

     

     

     

    具体送样细节,请咨询销售。