• RNA修饰是指发生在RNA分子上的各种化学修饰（已超160种），每种修饰都有相应的功能，如：稳定结构、出核运输、可变剪接、翻译识别等。其中甲基化修饰是主要形式之一，约占2/3，RNA的甲基化修饰多位于mRNA、tRNA、rRNA和其他非编码RNA上。

    5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，m5C），在RNA中广泛分布，早在上世纪70年代就已发现存在于mRNA上。当时由于技术的局限性，一直未能充分研究。近期研究发现mRNA m5C在哺乳动物中的分布十分保守，在不同组织中修饰的基因具有特异性。

    随着NGS的广泛应用，RNA修饰研究已是表观遗传领域的热点，而m5C-meRIP-seq则是强有力的研究技术之一。

    m5C-meRIP-seq可以在全基因组范围内精确检测RNA甲基化，对RNA样品进行片段化，利用特异性的RNA甲基化抗体进行免疫共沉淀反应，将含m5C修饰的mRNA从总mRNA中富集出来，需要设计Input对照样（类似与ChIP-seq）消除背景，利用高通量测序和生信分析，即可系统性研究m5C在全基因组范围内的修饰状况。

     

    m5C-meRIP-seq

  • 对于获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1、Fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、用BWA软件将Clean Data比对到参考基因组；

    3、Samtools对sam文件进行处理，整理排序并去除重复序列；

    4、MACS2进行Peak calling (q = 0.01)，寻找测序读段高覆盖峰；

    5、Deeptools对覆盖峰进行注释，并完成motif分析；

    6、借助R语言实现数据统计、制图、差异分析及功能富集分析。

    分析流程

    构建meRIP-seq文库，主要分为以下几步：

    1、提取总RNA，使用DNase I，去除DNA污染；

    2、沉淀RNA，乙醇洗涤，将产物置于超纯水中；

    3、测RNA浓度，热循环仪中孵育将RNA片段化；

    4、评估RNA片段化大小（200nt左右）；

    5、加入抗m5C抗体孵育；

    6、洗脱富集RNA；

    7、构建cDNA文库；

    8、上机测序。

    文库构建

  • 2019年8月，《NATURE CELL BIOLOGY》 刊发了中山大学附属肿瘤医院杨运桂等人的研究成果，文章揭示了人类膀胱尿路上皮癌（UCB）的激活机制，即NSUN2/YBX1/m5C-HDGF信号轴，促进UCB的发病机制。发现了RNA m5c调控癌基因激活的前所未有的机制，为UCB提供了一种潜在的治疗策略。

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    研究表明，在生理和/或病理条件下，RNA修饰(如m6A)可调节多种细胞功能。5-甲基胞嘧啶(m5C)也被报道参与RNA代谢调控。特别是，m5C不仅在rRNA和tRNA中被检测到，而且也在mRNA中被检测到。然而，这些研究主要集中在某些癌细胞系m6A图谱中确定的有限数量的基因上。对于病理条件下，特别是在人类实体肿瘤中，m5C等RNA修饰的分子动力学和/或功能的详细研究仍然缺乏。

    HDGF是肺癌、胰腺癌和乳腺癌中著名的致癌基因，与侵袭性疾病呈正相关，研究者们确定HDGF是在UCB进展过程中NSUN2和YBX1的重要靶点之一，并揭示了m5c修饰依赖于UCB中HDGF激活的关键机制。总的来说，文章提出了一个主要分子机制的工作模型，即NSUN2/YBX1/m5C-HDGF信号轴，促进UCB的发病机制。

  • RNA样品

    Total RNA: ≥300ug，RIN值要＞7.5；

     

     

     

    细胞或组织

    细胞量 ≥30million

    动物组织量 ≥500mg，植物组织量 ≥5g，建议样品制备 2~3 份

    具体细节详询销售。