综述解读 |单细胞与空间转录组学携手：绘制组织细胞 “动态地图”

一

 背景介绍 
在生命科学领域，单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学技术正引领着生物学研究的新变革。scRNA-seq能深入剖析单个细胞的转录组，精准识别组织内的细胞亚群，为我们打开了细胞特异性基因表达的微观世界大门。然而，它却无法揭示细胞在组织中的空间分布以及原位细胞间的通讯网络，就像一幅缺少空间维度的拼图，让我们难以完整地理解组织的奥秘。  与此同时，空间转录组学技术蓬勃发展，诸如多路原位杂交、原位测序（即高多重RNA成像）和空间条形码技术等，它们能够在组织中定位RNA，帮助我们了解细胞的空间位置信息。但这些技术目前在转录组覆盖范围和深度上仍不及scRNA-seq，各自存在局限性。
因此，将scRNA-seq与空间转录组学整合，成为解锁组织微观奥秘、揭示细胞间相互作用机制的关键钥匙，也为我们在正常组织发育、疾病发生发展机制研究等众多领域带来了全新的视角和无限可能。  
各位科研伙伴们！今天，让我们一同深入探索 “Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics” 这篇极具影响力的综述文章。它犹如一座知识宝库，系统地总结了单细胞RNA测序与空间转录组学整合的前沿进展，涵盖从技术原理到生物学应用，再到计算方法等多个重要层面。
Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics
Nature Reviews Genetics ( IF 39.1 ) Pub Date : 2021-06-18 , DOI: 10.1038/s41576-021-00370-8

 

二

 思路亮点
  • 综述思路：
  • 文章亮点：
  1. 技术整合意义重大
    强调单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）与空间转录组学整合的重要性，二者结合可定位单细胞在组织中的位置，深入理解细胞亚群作用及相互关系，助力研究组织发育、稳态和疾病机制。
  2. 生物应用成果丰富
    整合数据在多方面取得成果，涵盖正常组织（如肝脏、肠道等）稳态和发育研究，肿瘤微环境剖析，以及其他疾病（如阿尔茨海默病、心肌梗死等）和损伤微环境的探索，为相关疾病研究提供关键信息。
  3. 整合策略系统全面
    总结了整合 scRNA-seq 和空间转录组学数据的多种策略，包括反卷积和映射算法等，并分析其原理、应用场景和优缺点，为研究人员提供技术选择依据。
  4. 未来方向清晰明确
    指出未来研究方向，如整合更多数据模态（结合组织学图像分析）、定义 3D 空间转录组和实时细胞追踪，以及解析其他生物分子的空间分布，有望推动该领域进一步发展。
 

三

 综述内容
本文是一篇关于整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学技术的综述。文章围绕二者整合在揭示细胞间组织动态的作用展开，着重探讨技术整合的优势、应用成果、整合策略以及未来发展方向。在成果展示环节，主要从正常组织稳态和发育、肿瘤微环境、其他疾病和损伤微环境等方面，阐述了整合技术的具体应用成果；此外，还介绍了整合scRNA-seq和空间转录组学数据的策略，以及对未来的展望。 

1.整合数据的生物学洞察

正常组织稳态和发育：空间转录组学可用于研究多种正常组织的稳态和发育过程。在肝脏研究中（图 1），借助概率推断模型，研究人员将基于 scRNA-seq 的单细胞分子荧光原位杂交的细胞划分到九个离散区域，揭示了中间小叶细胞的新作用 。利用荧光激活细胞分选（FACS）、激光捕获显微切割（LCM）等技术，还能进一步明确肝脏代谢分区和再生过程中信号通路的空间动态变化。在肠道研究中，相关分析发现了沿绒毛轴的三个功能不同区域，增进了对肠道上皮细胞介导组织稳态的理解。此外，空间转录组学在骨髓、小鼠胚胎、大脑、生殖系统和心脏等组织的研究中也取得了重要成果，为深入了解正常组织的生物学机制提供了关键信息。

 

图 1：空间转录组学实验重点和整合数据的见解

a：空间转录组学实验聚焦于组织稳态、组织发育、疾病微环境和肿瘤微环境等方面，通过整合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学数据，可深入探究细胞亚群在这些过程中的作用。

b：scRNA-seq 用于识别细胞亚群，空间转录组学（高多重 RNA 成像或空间条形码技术）用于在组织中定位细胞亚群。

c：通过反卷积或映射算法，将 scRNA-seq 的细胞类型数据与空间转录组学数据进行整合，构建细胞类型图和生物特征注释。

d：利用空间信息的配体 - 受体算法，解码细胞间的通信机制，揭示细胞间相互作用的潜在机制。

 

肿瘤微环境：肿瘤微环境是目前空间转录组学研究最广泛的疾病领域。在人类鳞状细胞癌研究中（图 2），整合空间条形码和 scRNA-seq 技术，发现了肿瘤特异性角质形成细胞亚群，其与免疫治疗耐药相关，并能调节癌症相关成纤维细胞 。在胰腺癌研究中，通过整合 scRNA-seq 和空间条形码技术，揭示了炎症成纤维细胞在癌症应激反应中的重要作用。此外，空间数据还有助于分析肿瘤微环境的临床相关特征，为临床预后和治疗靶点的确定提供依据。

图 2：常见空间转录组学技术

A：高多重 RNA 成像（HPRI）

a：HPRI 通过靶向特定基因的探针定位 mRNA 转录本，荧光探针法采用编码方案，锁式探针法针对靶基因的互补 DNA（cDNA）设计探针。

b：HPRI 绘制的人类乳腺癌组织横截面图，mRNA 转录本根据基因荧光信号解码（未标注细胞类型，可通过映射标注），并列出 HPRI 方法的优缺点。

B：空间条形码技术

a：空间条形码技术利用空间标记的聚 T 寡核苷酸捕获组织横截面的 mRNA 转录本，后续测序并根据 ID 分配转录本来源。

b：空间条形码技术绘制的人类鳞状细胞癌横截面图，捕获点的 mRNA 混合物按细胞类型解卷积，同时列出该方法的优缺点。

 

其他疾病和损伤微环境：整合空间数据与 scRNA-seq 有助于阐明与疾病生物标志物相关的局部基因表达程序的分子发病机制。在阿尔茨海默病研究中（图 3），通过单分子荧光原位杂交和空间条形码技术，发现了与疾病相关的小胶质细胞亚群，并确定了其与淀粉样斑块的空间关系 。在心肌梗死研究中，整合单细胞核 RNA-seq（snRNA-seq）、空间条形码和单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq），绘制了基因调控网络，揭示了心脏瘢痕形成的机制。在斑马鱼心脏损伤修复研究中，分析冷冻切片发现了三个具有独特信号模式的空间限制区域，为研究心脏再生提供了新的视角。

 

图 3：整合 scRNA-seq 和空间转录组学数据的工作流程

a：选择实验重点，进行组织解离、空间条形码技术、HPRI 和 scRNA-seq 实验。

b：对组织进行检测，包括组织横截面的空间检测、反卷积、映射和细胞亚型识别。

c：组装组织地图，构建细胞类型图和生物特征注释。

d：分析数据，解码细胞间通信，进行空间信息的配体 - 受体和配体 - 受体 - 靶标分析。

 

2.整合策略

建立离散细胞亚型：scRNA-seq 能够检测到大量独特基因，揭示新的细胞亚型，并详细分析每个亚群的转录组。通过多种聚类方法，如 Seurat、SCANPY 和 SC3 等，可对细胞进行分类 。此外，还可通过计算机模拟亚聚类进一步识别感兴趣细胞类型中的亚群，并通过额外的 scRNA-seq 实验进行验证。因此，scRNA-seq 是目前定义组织中细胞亚群的最佳平台。

 

表 1：广泛使用的空间转录组学技术和仪器
类型
技术
特点
机制
注释
高多重 RNA 成像
用于保存组织和细胞 RNA 分析的原位测序
每个细胞 25 - 90 条读数<sup>10</sup>；69 个基因的面板<sup>31</sup>；需选择感兴趣的基因来设计基因靶向特异性 “锁式探针”
使用 “锁式探针” 机制，为特定基因设计探针
需预先选择基因；常用于研究保存的组织和细胞中的 RNA
高多重 RNA 成像
STARmap
160 个基因的面板；每个细胞约 250 条读数；整合水凝胶 - 组织化学以实现 3D 空间分辨率
使用 “锁式探针” 机制，并结合水凝胶 - 组织化学
可进行 3D 空间分析；技术相对复杂
高多重 RNA 成像
多重稳健误差荧光原位杂交（MERFISH）
135 个基因的面板；每个细胞约 100 条读数<sup>29</sup>；每个基因有一个相关的二进制编码（1 表示序列特定部分有荧光，0 表示无荧光）
基于二进制编码识别基因
可同时检测多个基因，但需要复杂的编码和解码过程
高多重 RNA 成像
顺序荧光原位杂交（seqFISH、seqFISH+）
249 个基因的面板；每个细胞约 30 条读数<sup>13</sup>；每个基因有一个相关的颜色序列编码（每个基因 24 个颜色探针，有 60 种不同的伪彩色选项）
通过颜色序列编码识别基因
可进行高分辨率的基因定位，但实验流程较繁琐
空间条形码技术
空间转录组学
捕获点分辨率 100μm 直径
利用微阵列的聚 T 寡核苷酸捕获 mRNA 转录本，后续进行测序
最初的空间转录组学技术，分辨率有限
空间条形码技术
Visium 空间基因表达技术
捕获点分辨率 55μm 直径；每个捕获点对应 3 - 30 个细胞
基于 10x Genomics Visium 平台，广泛应用；利用微阵列捕获 mRNA 转录本
操作相对简便，应用广泛
空间条形码技术
高清空间转录组学（HDST）
捕获点分辨率 2μm 直径
直接提高了空间转录组学的分辨率
分辨率高，但可及性较差
空间条形码技术
Slide - seq、Slide - seq v2
捕获点分辨率 10μm 直径；使用珠子代替捕获点，聚 T 寡聚物围绕珠子呈放射状突出；采用载玻片
可实现较高分辨率的空间转录组学分析
17, 18

 

研究组织微环境：高多重 RNA 成像（HPRI）和空间条形码技术都依赖于基于 scRNA-seq 数据的细胞类型推断。为了更清晰地定义和验证组织微环境中的细胞类型，可采用多种方法对细胞进行标记和测序。例如，使用光激活报告基因，如 GeoMx Digital Spatial Profiling、ZipSeq、转录组体内分析（TIVA）、NICHE-seq 等技术，可对特定组织微环境中的细胞进行标记和分析。此外，还可通过 FACS-based 方法对转移性微环境中的细胞进行分析，为研究组织微环境提供了有力的工具。

验证细胞类型分类：mRNA 可作为蛋白质表达的代理，通过多路基于表位的组织成像技术，如免疫荧光显微镜和成像质谱细胞术等，可对基于 scRNA-seq 的细胞类型分类进行验证 。这些方法能够提供有价值的基于蛋白质的证据，支持空间转录组学数据的分析。此外，新兴的整合方法，如同时测量 mRNA 转录本和蛋白质的成像质谱细胞术方法，以及相关算法，如 CellProfiler 等，有助于定量表征单细胞分辨率图像的细胞表型，进一步验证细胞类型分类的准确性。

数据整合方法：整合 scRNA-seq 和空间数据主要有反卷积和映射两种方法。反卷积旨在根据单细胞数据从每个捕获点的 mRNA 转录本混合物中分离离散的细胞亚群，包括基于推断的反卷积技术和基于富集分数的反卷积技术 。映射则是将基于 scRNA-seq 的细胞类型分配到 HPRI 数据中的每个细胞上，包括基于聚类的映射方法和基于概率模型的映射方法。此外，还有多种算法可用于整合 scRNA-seq 和空间数据，如 SPOTlight、SpatialDWLS、stereoscope、Robust cell-type decomposition（RCTD）、cell2location、pciSeq、Harmony、LIGER、Seurat Integration、SpaGE 等，这些算法在不同的应用场景中发挥着重要作用。

图 4：反卷积和映射方法

a：对于空间条形码数据，通过反卷积 mRNA 转录本混合物来预测每个捕获点的细胞类型比例。

b：对于 HPRI 数据，将基于 scRNA-seq 的细胞类型映射到每个空间分辨的细胞上。

c：基于回归的反卷积，利用 scRNA-seq 数据矩阵对捕获点的 mRNA 混合物进行反卷积。

d：概率建模，通过拟合概率分布来估计每个捕获点的细胞类型比例。

e：细胞类型评分（基于相对富集），计算细胞类型在捕获点的相对表达分数。

f：基于聚类的映射方法，如 LIGER、Seurat Integration 和 Harmony 等算法，通过不同方式将 scRNA-seq 和 HPRI 数据整合到低维空间进行细胞类型分配。

 

 

表 2：解析 scRNA - seq 和空间转录组学数据的研究
组织样本
输入数据
分析方法
亮点
肝脏（小鼠）
scRNA - seq、单分子荧光原位杂交（smFISH）
降维（t - 分布随机邻域嵌入，t - SNE）；将单细胞分配到 smFISH 区域
发现沿门 - 中央轴的新型中间小叶细胞类群
肝脏（小鼠）
荧光激活细胞分选（FACS） + 批量 RNA - seq、基因调控网络（GRN）分析、免疫荧光
将细胞分配到区域
发现 Wnt 信号通路具有空间分区的加工机制，对代谢分区和再生至关重要
肝脏（小鼠）
激光捕获显微切割（LCM） + 批量 RNA - seq
降维 - 主成分分析（DR - PCA）
对其他研究的表观基因组数据进行空间分辨率分析，以表征 Wnt 和 Notch 信号动态
肠道上皮（小鼠）
scRNA - seq、LCM + 批量 RNA - seq、smFISH、谱系追踪
t - SNE、伪时间分析
表征了沿绒毛轴先前未知的肠细胞功能空间分区
骨髓（小鼠）
scRNA - seq、LCM + 批量 RNA - seq、免疫荧光
批量反卷积（CIBERSORT） + t - SNE、配体 - 受体相互作用分析（RNA - Magnet）
将先前未知的骨髓细胞群体定位到不同的生态位
大脑 - 下丘脑视前区（小鼠）
scRNA - seq、高多重 RNA 成像（MERFISH）、smFISH
t - SNE、细胞类型注释（通过对 HPRI 数据单独聚类）
绘制特定细胞亚型，并通过基因活性识别与这些细胞类型相关的行为
精子发生过程
空间条形码（SB）、smFISH
主成分分析（PCA）、伪时间分析、SB 反卷积（NMFReg17 方法）
与糖尿病小鼠睾丸比较，揭示生精小管的空间失调
胚胎肠道（人类）
scRNA - seq、SB
统一流形近似和投影（UMAP）、SB 反卷积（使用 Seurat Integration）、配体 - 受体相互作用（SingleCellSingalR）
绘制小肠形态发生的时空动态，关注与肠道发育缺陷相关的细胞类型
胚胎心脏（人类）
scRNA - seq、SB、HPRI、smFISH
t - SNE、SB - 细胞类型注释（SB - CTA）、3D 绘制心脏形态发生转录组模式（HPRI - CTM，pciSeq）
在关键时间点对不同解剖区域的心脏形态发生转录组模式进行 3D 绘制
脊髓（小鼠）
SB、免疫荧光
SB - CTA（标记为基因模块）
对肌萎缩侧索硬化症小鼠的 31 个与疾病相关的基因模块进行空间映射
鳞状细胞癌（人类）
scRNA - seq、SB、多重离子束成像（MIBI）
UMAP、SB - CTA（Seurat 富集评分）、LRI（NicheNet）
通过与匹配的正常皮肤比较，表征人类鳞状细胞癌，发现肿瘤特异性角质形成细胞
胰腺导管腺癌（人类）
scRNA - seq、SB、免疫荧光
t - SNE、SB - CTA（富集评分）
表征人类胰腺导管腺癌，发现应激反应癌细胞状态与炎性成纤维细胞共定位
皮肤恶性黑色素瘤
SB
PCA
对不同生存结局的黑色素瘤患者的淋巴结活检进行表征
大脑（阿尔茨海默病小鼠模型和人类）
SB、HPRI、免疫荧光
t - SNE、基因模块富集分析
识别出两个在靠近淀粉样斑块的脑区细胞中表达的基因网络
大脑（阿尔茨海默病小鼠模型）
scRNA - seq、smFISH、免疫荧光
t - SNE、伪时间分析
识别出一种新的与疾病相关的小胶质细胞，定位于淀粉样斑块附近
心肌梗死后心脏（人类）
单细胞核 RNA - seq（snRNA - seq）、单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC - seq）、SB、原位杂交（ISH）
UMAP、SB - CTA（使用 Seurat Integration）、伪时间分析
整合 snATAC - seq 数据，定位相对于梗死区域的空间特异性增强子可及性或转录因子结合
心脏（斑马鱼）
冷冻切片 + 批量 RNA - seq、smFISH、免疫荧光
细胞类型注释（CTA）
对冷冻损伤心脏伤口边界区域的心肌细胞再生信号进行空间划分

 

3.未来方向

整合更多数据模态：目前的空间转录组学技术主要侧重于测量 mRNA 转录本，然而组织学图像等数据往往未被充分利用。ST-Net 和 XFuse 等深度学习算法可预测空间条形码捕获点的基因表达，并结合组织学信息进行分析 。未来，进一步开发深度学习模型，有助于更好地整合 scRNA-seq 和空间转录组学数据集，揭示细胞类型和基因表达的信息。

表 3：单细胞和空间整合策略
算法
策略类型
推荐数据
输出
SPOTlight
反卷积
scRNA - seq 和空间条形码
每个捕获点的估计细胞类型比例
SpatialDWLS
反卷积
scRNA - seq 和空间条形码
每个捕获点的估计细胞类型比例
stereoscope
反卷积
scRNA - seq 和空间条形码
基于最大后验估计（MAP）的每个捕获点的估计细胞类型比例
Robust cell - type decomposition（RCTD）
反卷积
scRNA - seq 和空间条形码
基于 MAP 估计的每个捕获点的估计细胞类型比例
cell2location
反卷积
scRNA - seq 和空间条形码
基于 MAP 估计的每个捕获点的估计细胞类型比例
富集分析（Multimodal intersection analysis，MIA）
反卷积
scRNA - seq 的细胞类型特异性基因和空间条形码的区域特异性基因
某些 scRNA - seq 细胞类型在空间条形码数据的组织区域（根据苏木精和伊红（H&E）染色注释）中的富集或消耗值
相对表达评分（富集分析）
反卷积和映射
scRNA - seq（用于细胞亚型）、空间条形码和 HPRI
每个捕获点或单细胞的相对细胞类型表达分数
pciSeq
映射
scRNA - seq 和 HPRI
每个细胞的细胞类型分配概率饼图
Harmony
映射
scRNA - seq 和 HPRI
基于共享聚类，将 HPRI 数据中的每个细胞分配一个源自 scRNA - seq 的细胞类型
LIGER
映射
scRNA - seq 和 HPRI
基于共享聚类，将 HPRI 数据中的每个细胞分配一个源自 scRNA - seq 的细胞类型；通过对齐因子空间中最近的 scRNA - seq 邻居的平均值来估算空间分辨单细胞的基因表达
Seurat Integration
映射
scRNA - seq 和 HPRI
基于锚点的细胞类型，为 HPRI 细胞分配细胞类型；通过其锚定的 scRNA - seq 对来估算每个 HPRI 细胞的基因表达
SpaGE
映射
scRNA - seq 和 HPRI
通过 k - 最近邻回归估算每个 HPRI 细胞的基因表达
Fawkner - Corbett 等人（2021）
空间配体 - 受体分析
scRNA - seq 和空间条形码
用于确定配体 - 受体对是否在空间上共定位的 p 值和系数；可生成单个捕获点内或相邻捕获点之间的输出
Giotto
空间配体 - 受体分析
HPRI 或空间条形码
每对细胞类型的细胞 - 细胞通信分数
SpaOTsc
空间配体 - 受体分析
scRNA - seq 和 HPRI
2D 或 3D 的细胞 - 细胞信号图
SVCA（空间方差成分分析）
空间配体 - 受体分析
HPRI
量化每个基因的方差可由细胞 - 细胞相互作用（以及其他因素）解释的程度

 

定义 3D 空间转录组和实时细胞追踪：目前多数 3D 空间转录组研究采用高分辨率切片和计算重建的方法，而 STARmap 和 ExSeq 等新方法可在完整组织中实现 3D 空间转录组分析 。此外，光学相干断层扫描和 CellGPS 等技术可用于实时追踪细胞亚型的动态变化，结合 RNA timestamping 技术，可记录转录动态，为研究空间组织动态提供更全面的视角。

解析其他生物分子的空间分布：DBiT-seq 等技术可在同一组织中同时解析蛋白质和 mRNA 转录本的空间分布，未来还可进一步扩展到解析空间表观基因组等 。3D 成像、亚细胞分辨率 RNA 分析和染色质组织成像等技术的发展，有望彻底改变我们对分子生物学中心法则在细胞 3D 环境中运作机制的理解，为研究发育轨迹和疾病提供新的视角。

临床应用：空间转录组学在临床研究中具有重要潜力，通过比较疾病和健康组织的空间转录组，可阐明预后、优化治疗方案和确定潜在治疗靶点 。未来，通过聚合更多患者的数据，结合深度学习模型，有望提高空间转录组学数据的临床相关性和预测预后的能力，为精准治疗提供有力支持。

图 5：细胞间通信分析

A：受配体 - 受体邻近性限制，根据共表达细胞的接近程度评估配体 - 受体相互作用的可能性。

B：受配体 - 受体 - 靶标共表达限制，通过评估配体下游信号靶标的表达水平计算信号的最大空间范围。

四

 讨论展望
  • 能获高分原因
    ：聚焦前沿热点，整合 scRNA-seq 与空间转录组学技术意义重大；内容全面，涵盖技术原理、生物应用、计算方法等多方面；方法学总结系统，为研究提供重要参考 。
  • 受限原因
    ：缺乏原创性研究数据，多为已有研究的综合；对技术局限性讨论不够深入，缺乏克服局限的具体方案。
  • 改进方向
    ：补充前沿技术进展，深入介绍新兴技术突破；强化临床应用，结合更多临床样本分析；完善未来研究方向，提出具体实验设计和研究思路 。
     
最后，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）与空间转录组学技术的整合已取得显著进展，但仍面临诸多挑战与机遇。在技术整合方面，尽管当前已开发出多种算法用于整合 scRNA-seq 和空间转录组学数据，但仍需进一步优化以提高准确性和效率。例如，反卷积和映射算法在处理复杂组织和细胞异质性时存在局限性，未来应开发更精准的算法，充分考虑细胞间的相互作用和空间位置信息，以更准确地解析细胞亚群和基因表达模式。
 
 

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转录组：mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA、tRNA测序；
表观组：ATAC-seq，CUT&Tag、ChIP-seq、WGBS、DAP-seq、TBS、Hi-C；
蛋白和RNA互作：RIP-seq和eCLIP-seq；
翻译组：Ribo-seq；
单细胞测序:scRNA-seq、scCUT&Tag、scATAC-seq、scV(D)J-seq;
空间表观转录组测序:Spatial RNA-seq 、Spatial ATAC-RNA-seq、Spatial CUT&Tag-RNA-seq;
RNA修饰类：m6A、m1A、m7G、m5C、ac4C、Ψ假尿嘧啶等；
基因编辑脱靶检测：GUIDE-seq、CIRCLE-seq、dCas9-ChlP-seq、DISCOVER-seq等基于靶向测序的脱靶检测。

 

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