文献追踪 |epigenomic MERFISH：开启单细胞空间表观基因组分析新时代

技术流程与优化：epigenomic MERFISH 技术通过原位捕获染色质上的表观遗传修饰，用 T7 启动子标记 DNA，原位转录生成 RNA，再利用 MERFISH 成像检测 RNA，从而实现对大量表观遗传修饰染色质位点的同时成像（图 1A）。

图 1.Aepigenomic MERFISH 技术工作流程示意图

在 hTERT - RPE1 细胞中优化固定条件，发现轻 PFA 固定结合 HCl 处理能实现目标位点附近的准确转座。通过测序检测转录 RNA，其长度分布在 100 - 1000 碱基，且该方法测得的 H3K27ac 和 H3K4me3 基因组图谱与 ChIP - Seq 和 CUT&Tag 结果相符，但峰高较低（图 S1B、S1C、S1D）。

图 S1B、S1C、S1D.

图 S1B 展示了 hTERT - RPE1 细胞中不同固定和处理条件下，原位转录的 H3K27ac 和 H3K4me3 修饰 RNA 测序结果与 ChIP - seq、CUT&Tag 测量结果的对比数据，表明经清除处理和 5min PFA 固定的样本测序结果更好；图 S1C 呈现了原位转录 RNA 与 CUT&Tag 在 H3K4me3（蓝色）和 H3K27ac（红色）两种染色质标记的全基因组结合图谱对比数据；图 S1D 展示了 hTERT - RPE1 细胞中经原位 Tn5 转座和 T7 转录生成的 H3K4me3 修饰 RNA 的长度分布在 100 - 1000 碱基的数据。

成像验证与检测效率：对 90 个 H3K27ac 阳性位点进行 MERFISH 成像（图 1B），图像清晰可解码，目标位点的解码斑点数量平均比空白条形码多约 30 倍（图 1C）。用对照 IgG 替代 H3K27ac 抗体后，目标位点的解码斑点数量减少约 10 倍，表明检测结果特异性高，且生物学重复间结果可重复（图 1D）。对 52 个关键基因启动子的检测发现，该技术检测效率高于单细胞 CUT&Tag（~1 - 8%）和单细胞 ATAC - seq（~5 - 10%）（图 1E、1F、1G）。

图 1B - G：epigenomic MERFISH 技术在细胞水平的验证结果

成年小鼠大脑皮层：研究人员针对成年小鼠大脑皮层，选取了 127 个基因的 H3K4me3 标记的活性启动子进行成像分析（图 2A）。

图 2A：成年小鼠皮层中位点特异性活性启动子的空间分辨单细胞分析

左图：展示成年小鼠大脑冠状切片体感皮层区域 127 个目标 H3K4me3 位点的 epigenomic MERFISH 图像，呈现了在该区域内众多目标位点的整体分布情况。

右上角图：是左图红色框区域的放大图，聚焦于单个细胞层面，展示了 H3K4me3 位点的解码斑点，能更清晰地观察到细胞内位点的分布细节。

右下角图：为右上角图蓝色框区域的进一步放大图，其中细胞核分割为白色，解码斑点依据基因组位点的染色体身份进行颜色编码，这种可视化方式有助于更精准地识别和分析每个位点在细胞内的具体位置和分布特征 。

这些基因涵盖了区域特异性表达基因、层特异性表达基因以及神经元亚型标记基因。在对这些基因的研究中，通过 epigenomic MERFISH 技术，详细观察了 H3K4me3 信号在不同细胞层的分布情况，并与 RNA MERFISH 测量的基因表达模式进行对比。结果显示，像 Cux2 和 Unc5d 基因的启动子 H3K4me3 信号在 II/III 和 IV 层富集，Rorb 和 Slc17a6 基因启动子的 H3K4me3 信号在 IV 层富集，Fezf2 基因启动子的 H3K4me3 信号在 V 和 VI 层富集，Foxp2 基因启动子的 H3K4me3 信号在 VI 层富集，这些基因的 H3K4me3 信号层富集模式与 RNA MERFISH 测量的基因表达模式表现出相似性（图 2B、2C）。

图 2B：成年小鼠皮层中位点特异性活性启动子的空间分辨单细胞分析.

图 2C：成年小鼠皮层中位点特异性活性启动子的空间分辨单细胞分析.左图：六个基因启动子 H3K4me3 信号层富集的 epigenomic MERFISH 图像，图中每个点代表一个细胞，红色点表示 H3K4me3 信号呈阳性的细胞。左侧层富集热图从图 2B 复制而来，依底部色标用颜色呈现。右图：六个基因的 RNA MERFISH 图像，展示 RNA 表达的层富集情况（数据来自 Zhang 等人，2021），每个细胞中的 RNA 表达水平依底部色标进行颜色编码。

不过，研究也注意到部分位点的 H3K4me3 信号分布与 RNA MERFISH 结果存在差异，然而多数此类差异的程度相对较小，通过对 H3K4me3 图像的直观观察，这些位点并未呈现出明显的层特异性富集特征。

胚胎小鼠大脑：在胚胎期 13.5 天（E13.5）的小鼠大脑研究中，同样对 127 个基因的 H3K4me3 标记的活性启动子展开成像（图 3A）。

图 3A：小鼠胚胎大脑中活性启动子的空间分辨分析

左图：为胚胎期 13.5 天（E13.5）小鼠大脑矢状切片的示意图，着重标记出了不同的脑区，包括皮层（Cortex）、亚皮层（Subpallium）、间脑（Diencephalon）、中脑（Midbrain）和后脑（Hindbrain）。背景显示的是 DAPI 染色信号，用于标记细胞核，为观察不同脑区的结构提供参考。

中图：呈现了 127 个目标 H3K4me3 位点的 epigenomic MERFISH 成像结果。通过该技术，研究人员能够在组织切片上对这些标记活性启动子的位点进行可视化，图中的斑点代表检测到的 H3K4me3 位点，展示了这些位点在整个大脑切片上的分布情况。

右图：是中图中脑区域橙色框部分的放大图。所有解码后的斑点都绘制在 DAPI 信号的背景上，并根据基因组位点的染色体身份进行颜色编码。这样可以更清晰地观察到中脑区域内单个细胞中 H3K4me3 位点的分布细节，有助于研究人员分析特定脑区中活性启动子的分布特征 。

研究人员将小鼠大脑划分为皮层、亚皮层、间脑、中脑和后脑这五个主要区域，通过计算每个区域内的斑点密度，来深入分析这些启动子的空间分布情况。研究发现，众多位点在特定脑区呈现出表达富集的现象。例如，Tbr1 和 Fezf2 的启动子在皮层区域表现出 H3K4me3 信号的富集，这与 Allen 脑原位杂交（ISH）图谱中相应基因的表达模式高度一致。此外，像 Emx1、Emx2、Bcl11b 和 Eomes 等典型的皮层发育转录因子，其启动子的 H3K4me3 信号也在皮层区域富集。作为端脑标记的 Foxg1 基因，其启动子的 H3K4me3 信号在皮层和亚皮层区域呈现出预期的富集。一些远端少同源结构域转录因子（如 Dlx1、Dlx2 和 Dlx5），其启动子的 H3K4me3 信号在亚皮层和间脑区域富集，这与它们在 Allen ISH 图像中的基因表达模式相符，也与这些基因在促进前脑抑制性神经元发育中的重要作用相契合。类似地，一些典型的抑制性神经元标记（如 Slc32a1 和 Gad2）的启动子在亚皮层区域显示出 H3K4me3 信号，而兴奋性神经元标记（如 Slc17a6）的启动子在该区域则未检测到 H3K4me3 信号。Isl1 基因的启动子在间脑区域呈现 H3K4me3 信号富集，这既与 Allen ISH 图像中该基因的表达模式一致，也符合其在分化的下丘脑神经元亚群中的表达情况。中脑和 / 或后脑特异性转录因子（如 Tfap2d、Otx2、Ebf1、Lhx1、Erbb4 和 En2）的启动子，在中脑和 / 或后脑区域表现出预期的 H3K4me3 信号富集（图 3B、3C）。

图 3B：小鼠胚胎大脑中活性启动子的空间分辨分析。热图展示 127 个目标 H3K4me3 位点在不同脑区的标准化区域富集情况。

图 3C：小鼠胚胎大脑中活性启动子的空间分辨分析。对比展示十个转录因子启动子的 H3K4me3 信号的 epigenomic MERFISH 图像与 Allen 脑原位杂交（ISH）图谱中对应基因的表达模式图像，验证该技术测量结果与已知基因表达模式的一致性。

成年小鼠大脑皮层：由于缺乏层特异性的大量 H3K27ac 测序数据，研究人员借助 ATAC - seq 数据来筛选潜在活性增强子位点。他们从已发表的数据中挑选出 139 个 ATAC 峰，这些峰满足距离已知基因转录起始位点（TSS）大于 2kb、在某一皮层层有信号富集且在大量 H3K27ac ChIP - Seq 数据中有非零读数的条件，其峰的中位数长度约为 250bp。

图 4A：成年小鼠皮层中位点特异性潜在活性增强子的空间分辨单细胞分析

上图：为成年小鼠大脑冠状切片体感皮层区域 139 个目标 H3K27ac 位点的 epigenomic MERFISH 成像图，展示了该区域众多目标位点的整体分布情况，可直观呈现潜在活性增强子位点在组织层面的分布特征。

左下角图：是上图红色框区域的放大图，聚焦于单个细胞层面，展示了 H3K27ac 位点的解码斑点，能更清晰地观察到细胞内位点的分布细节，有助于分析单个细胞中潜在活性增强子的分布情况。

右下角图：为左下角图蓝色框区域的进一步放大图，其中细胞核分割为白色，解码斑点依据基因组位点的染色体身份进行颜色编码，这种可视化方式有助于更精准地识别和分析每个位点在细胞内的具体位置和分布特征，对于研究潜在活性增强子在细胞内的定位和功能具有重要意义。

利用 epigenomic MERFISH 技术对这些位点进行成像（图 4A），研究人员在成年小鼠包含体感皮层的冠状切片中分析了约 3,600 个单细胞。结果显示，成像结果对 H3K27ac 抗体具有特异性，且在重复实验中表现出一致性。在这 139 个目标位点中，35 个呈现出统计学显著的层特异性模式。考虑到约 50% 的 ATAC - seq 峰与 H3K27ac ChIP - seq 测量的峰不重叠，许多位点未显示出 H3K27ac 信号的层特异性富集并不意外。实际上，呈现显著层特异性富集的 35 个位点，其平均 H3K27ac 信号高于未显示显著层特异性富集的位点。在这些位点中，部分位点的 H3K27ac 信号层富集模式与附近基因的空间表达模式相似。

以 Unc5d 基因附近的三个潜在增强子位点（loci 123、124 和 127）为例，它们在 II/III 和 IV 层呈现出一致且显著的富集（图 S5A、S5B），同时 Unc5d 基因在这些层的表达也有所富集。通过现有小鼠大脑的 Hi - C 数据发现，这三个位点与 Unc5d 基因位于同一亚拓扑相关结构域（sub - TAD），这表明这些位点可能是 Unc5d 基因的潜在增强子，凸显了 epigenomic MERFISH 技术在识别潜在启动子 - 增强子对方面的能力。

图 S5A：成年小鼠皮层中 H3K27ac 位点测量的准确性和特异性分析

小提琴图展示成年小鼠皮层实验结果。左图为使用 H3K27ac 抗体捕获表观遗传标记时，每个目标 H3K27ac 位点的平均解码斑点数；中图是空白条形码的平均解码斑点数；右图则是使用对照 IgG 替代 H3K27ac 抗体时，每个目标 H3K27ac 位点的平均解码斑点数。图中每个点代表一个 H3K27ac 位点或空白条形码，用于评估该实验测量的准确性与特异性。

图 S5B：成年小鼠皮层中 H3K27ac 成像的重复性分析

散点图呈现成年小鼠皮层中 H3K27ac 成像两个生物学重复间的相关性，图中每个点对应一个 H3K27ac 位点，通过该图可直观了解实验结果的重复性情况。

胚胎小鼠大脑：在 E13.5 胚胎小鼠大脑的研究中，研究人员基于先前胚胎大脑的 ChIP - Seq 数据，选取了 142 个 H3K27ac 阳性位点和 5 个 H3K27ac 计数较低的位点作为阴性对照（图 4B）。

图 4B：成年小鼠皮层中位点特异性潜在活性增强子的空间分辨单细胞分析

实验结果显示，5 个阴性对照位点的检测斑点数量与空白条形码相当，且比 H3K27ac 阳性位点少约 10 倍，这表明该实验的假阳性检测率较低。为进一步验证结果，研究人员将 epigenomic MERFISH 信号按照前脑、中脑和后脑这三个主要脑区进行分组，并与先前 E13.5 相应脑区的 ChIP - Seq 数据进行比较，发现两者的区域特异性富集模式相似。为深入探究这些潜在活性增强子的空间分布，研究人员基于 H3K27ac 信号的空间分布对这些位点进行层次聚类分析，最终得到六个主要聚类，分别对应中脑、皮层、前脑、原节、间脑 + 后脑和后脑这六个脑区的富集模式。

通过使用 MEME 进行基序搜索分析，研究人员在这些聚类中发现了已知的转录因子基序，如 Ascl2、Rfx、Zfp652、Tcf7l2、Sfip1 和 Sp2 等，同时也发现了一些先前未知的基序。对各个聚类中位点的 H3K27ac 信号进行详细的可视化观察，揭示出更精细的空间模式。在皮层聚类中，loci 76、106、6、5、94 等位点的 H3K27ac 信号从皮层的顶端到基底呈现出渐进式的变化；在胚胎后脑聚类中，loci 23、100、63、42、27 等位点在不同的后脑亚区域表现出有趣的局部富集现象。此外，研究人员通过比较潜在增强子的 H3K27ac 信号空间模式与附近基因的表达模式，对潜在的启动子 - 增强子对进行预测。在 142 个成像的潜在增强子位点中，有 6 个位于先前预测的与 E13.5 大脑中已有 ISH 数据的基因相关的潜在增强子区域，其中 3 个位点的 H3K27ac 信号空间模式与预测的基因靶标的表达模式相匹配（图 4C、4D、4E），为先前的预测提供了进一步支持。同时，研究还发现如 loci 95、31、107 等位点的 H3K27ac 信号空间分布与它们在基因组空间中最近基因（Tbr1、Foxg1 和 Pax7）的空间表达模式相匹配，这表明这些潜在增强子可能对相应基因具有调控作用。

在胚胎小鼠大脑研究中，研究人员发现多个潜在增强子位点可形成增强子枢纽，对重要基因表达进行调控。这一发现通过对不同脑区的潜在增强子位点分析获得，为理解基因表达调控机制提供了新视角。

prosomer 区域的增强子枢纽：在 prosomer 区域，研究人员观察到一组十个潜在增强子位点（Loci 66 - 75）（图 6A、6B）。

图 6A、6B：小鼠胚胎大脑中发育重要基因的潜在活性增强子枢纽 —— 原脑区簇相关分析

图 6A：呈现原脑区簇 10 个目标位点的 H3K27ac 信号的 epigenomic MERFISH 图像与附近 Tcf7l2 基因的 Allen ISH 图像（右下角）。白色、黑色箭头分别指向 H3K27ac 和 RNA ISH 信号最富集区，二者重合暗示该区域基因调控活跃。绿色框标记含 Tcf7l2 基序的位点，与 Tcf7l2 基因表达调控可能密切相关。

图 6B：上图为 H3K27ac ChIP 测序图谱，展示含原脑区富集的 10 个目标位点及 Tcf7l2 基因的亚拓扑相关结构域（Chr19:55,318,000 - 55,980,000）内 H3K27ac 修饰分布。下图是基因组区域（Chr19:50,000,000 - 60,000,000 ，50 - kb 分辨率，Knight - Ruiz 标准化）的 Hi - C 接触图谱，包含上述结构域及侧翼区域，上方放大展示该结构域（10 - kb 分辨率，Knight - Ruiz 标准化）的染色质三维空间构象，为研究基因表达调控提供依据。

这些位点在基因组空间上距离 Tcf7l2 基因的启动子较近，都在 ± ~300 kb 范围内，且处于同一亚 TAD 中。从图 6A 中可以看到，这十个增强子的 H3K27ac 信号在 prosomer 区域呈现出明显的富集现象，这种富集模式与 Tcf7l2 基因的空间表达模式高度相似。对这些位点进行基序搜索分析发现，其中七个位点富含 Tcf7l2 基序（图 6A 中绿色框标记的位点，相关基序见图 S7）。这表明 Tcf7l2 作为发育重要的 Wnt 信号通路的下游转录因子，可能通过结合自身的增强子来建立正反馈回路，以确保自身的稳定表达。

hindbrain 区域的增强子枢纽：在 hindbrain 区域，研究发现五个潜在增强子位点（Loci 41 - 45）靠近 Hoxc4 基因的启动子（图 6C、6D）。Hoxc4 基因已知在 hindbrain 区域表达，而这五个潜在增强子位点与 Hoxc4 基因位于同一亚 TAD 中（图 6D）。从图 6C 中可以看出，这些位点的 H3K27ac 信号空间模式与 Hoxc4 基因的空间表达模式相似，暗示它们可能形成增强子枢纽，对 Hoxc4 基因（甚至可能包括其他 Hoxc 基因）的表达进行调控。

图 6C：小鼠胚胎后脑簇相关潜在活性增强子及基因表达分析

展示了位于后脑簇的 5 个目标位点的 H3K27ac 信号的 epigenomic MERFISH 图像，以及附近基因 Hoxc4 的 Allen ISH 图像（右下角）。通过对比二者，研究潜在活性增强子位点与 Hoxc4 基因表达在空间上的关联，为探究后脑发育相关基因调控提供依据。

图 6D：小鼠胚胎后脑簇相关分子图谱解析

上图：H3K27ac ChIP 测序图谱（Gorkin 等人，2020），呈现含有后脑簇富集的 5 个目标 H3K27ac 位点及多个 Hoxc 基因的亚拓扑相关结构域（sub - TAD）区域（Chr15:102,915,000 - 103,172,000 ）内 H3K27ac 修饰分布情况。

下图：基因组区域（chr15:102,356,000 - 103,716,000，5 - kb 分辨率，Knight - Ruiz 标准化）的 Hi - C 接触图谱，涵盖上述亚拓扑相关结构域及侧翼区域，上方放大展示该亚拓扑相关结构域（Chr15:102,915,000 - 103,172,000，5 - kb 分辨率，Knight - Ruiz 标准化）的染色质三维空间构象，从分子层面揭示潜在活性增强子位点与 Hoxc4 等基因的关联 。

cortex 区域的增强子枢纽：cortex 区域同样存在类似的增强子枢纽结构。研究人员发现五个潜在增强子位点（Loci 128 - 132）靠近 Neurod6 基因的启动子（图 6E、6F）。Neurod6 基因在 cortex 区域表达，这五个位点与 Neurod6 基因处于同一亚 TAD（图 6F）。如图 6E 所示，这些潜在增强子位点的 H3K27ac 信号空间模式与 Neurod6 基因的空间表达模式相匹配，说明它们可能形成增强子枢纽来调控 Neurod6 基因的表达。

图 6E，呈现皮层簇中 5 个目标位点的 H3K27ac 信号的 epigenomic MERFISH 图像，以及附近基因 Neurod6 的 Allen ISH 图像（右下角）。对比二者，可观察到这些位点的 H3K27ac 信号与 Neurod6 基因表达模式在空间上的关联，为研究皮层发育相关基因调控机制提供依据。

图 6F，上图：H3K27ac ChIP 测序图谱（Gorkin 等人，2020），展示含有皮层簇富集的 5 个目标 H3K27ac 位点及 Neurod6 基因的亚拓扑相关结构域（sub - TAD）区域（Chr6:55,503,000 - 56,053,000 ）内 H3K27ac 修饰分布。下图：基因组区域（Chr6:54,603,000 - 56,756,000，5 - kb 分辨率，Knight - Ruiz 标准化）的 Hi - C 接触图谱，涵盖上述亚拓扑相关结构域及侧翼区域，上方放大展示该亚拓扑相关结构域（Chr6:55,503,000 - 56,053,000，5 - kb 分辨率，Knight - Ruiz 标准化）的染色质三维空间构象，揭示潜在活性增强子位点与 Neurod6 基因在染色质层面和空间上的紧密联系 。

综合上述不同区域的研究结果（图 6A - 6F），充分表明通过空间分辨的表观遗传分析方法，能够有效地预测潜在的增强子枢纽，为深入研究基因表达调控提供了重要依据，有助于进一步揭示胚胎大脑发育过程中基因调控的复杂机制。

在本研究中，研究人员开发了epigenomic MERFISH技术，实现了对单细胞表观基因组的空间分辨分析。该技术通过原位标记、转录和多重成像，能够在单细胞水平上对染色质上的表观遗传修饰位点进行高分辨率、高通量的分析，其基因组分辨率小于1kb，且可同时对数百个基因组位点进行成像。应用该技术对小鼠胚胎和成年大脑进行研究，发现其能有效揭示活性启动子和潜在增强子的区域特异性分布，还预测了新的增强子 - 启动子对和增强子枢纽，这些结果与已知的基因表达模式相符，同时也揭示了此前未知的潜在增强子的精细空间分布 。与基于测序的单细胞表观基因组分析方法相比，epigenomic MERFISH保留了细胞的空间背景，具有更高的空间分辨率，但该技术是靶向性的，需要对表观基因组位点进行预先选择。尽管如此，研究人员预计该技术可同时分析数千个基因组位点，从而部分弥补这一局限性。此外，epigenomic MERFISH具有广泛的应用前景，可用于研究多种表观基因组特性，还能与其他成像技术结合，实现单细胞空间多组学分析，为深入理解转录调控机制以及基因调控在组织发育和功能中的作用提供有力工具。