项目文章 | CRISPR FISHer：基于相分离信号放大的高敏活细胞非重复DNA元件示踪方法

染色质和染色质外DNA的空间结构及其动态变化，能够调节细胞的基本生理活动。但是，在活细胞中给特定DNA片段，尤其是占据基因组大部分的非重复序列显像，目前还没有什么比较理想的方法。
今年9月Cell Research发表了题为CRISPR FISHer enables high-sensitivity imaging of nonrepetitive DNA in living cells through phase separation-mediated signal amplification的论文，提出了一种基于CRISPR和相分离的非重复DNA片段标记工具CRISPR FISHer，并通过该工具实现了单个活细胞内染色体断裂、分离以及同源/异源末端连接过程的实时成像，以及外源DNA的片段示踪。
工作由西湖大学生命科学院等机构联合完成，第一作者宋春青和申恩志。我司提供了文献中Circle-seq测序和分析工作方面的支持。

 

 

研究背景

 

DNA作为遗传物质，一直处于动态变化中但整体上看是时空间有序的。基因组的不稳定和染色质的结构变异可能导致DNA损伤和随后的修复，这一过程有时会产生染色质外DNA（ecDNA）。某些外源DNA也会整合进宿主的核基因组，导致宿主细胞的功能异常。可视化核DNA的空间分布以及动态变化，有助于进一步研究这些过程，但是实时跟踪特定的核DNA片段难度很大。

先前的基因组成像手段需要大量地将外源序列（例如乳糖操纵子）引入基因组，工程量巨大不说，外源序列插入还有可能干扰靶点的正常功能。CRISPR/Cas9系统有改造后用于内源基因组位点的成像和示踪的报道，不过早期的CRISPR示踪方法需要针对串联重复位点，或者是针对靶点前后大范围的sgRNA组合，而人的基因组中并没有多少串联重复序列。此外，早期的CRISPR示踪方法信噪比也不理想，还不足以用于非重复序列的成像和示踪。

为了解决这些问题，研究小组想到了应用相分离放大信号，于是有了本文中的CRISPR介导荧光原位杂交信号放大（CRISPR FISHer）方法，该方法只使用一种sgRNA就能稳定地实现内源非重复DNA序列的成像，大幅扩展了基于CRISPR的活细胞成像技术的应用范围。

 

 

方法与结果

 

1. CRISPR FISHer设计原则 

CRISPR FISHer是基于CRISPR/Cas9系统设计的，但其中使用的sgRNA有所不同。CRISPR FISHer所使用的sgRNA的末端有两个PP7配体（sgRNA-2×PP7），可以结合PP7包膜蛋白-绿色荧光蛋白-T4噬菌体fibritin三聚体结构域融合蛋白（foldon-GFP-PCP）。foldon-GFP-PCP在纯化条件下可以稳定形成可溶性的三聚体，并且能同带有2个及以上PP7配体的sgRNA形成复合物沉淀，而沉淀的形成量同PP7配体的数量似乎没有关联。这表明，fibritin三聚体结构域似乎能指数级地增强foldon-GFP-PCP-sgRNA-PP7复合物的形成。

 

Figure 1. Trimeric foldon triggers the assembly of foldon-GFP-PCP protein and sgRNA with PP7 aptamers

 

2. CRISPR FISHer的重复位点成像信噪比更高 

为了验证foldon-GFP-PCP在活细胞中能否被募集到CRISPR靶点并富集，研究小组用针对3号染色体长臂2区9带的重复序列（以下简称Chr3Rep）的sgRNA-2×PP7（sgChr3Rep）与mCherry标记的dCas9标记了U2OS细胞的Chr3Rep，随后向核内转染了表达foldon-GFP-PCP的质粒。荧光成像提示，核转染后4小时就能在细胞中观察到foldon-GFP-PCP在Chr3Rep上聚集，并随着时间流逝而愈发明显，而dCas9没有显著的富集。这说明靶序列-dCas9-sgChr3Rep可能募集了foldon-GFP-PCP，并增强了GFP信号。通过后续实验，研究小组排除了转染时序和位点对结果造成影响的可能性。
随后，研究小组以U2OS细胞中的端粒为靶点，对比了CRISPR FISHer同另外两种CRISPR成像方法（dCas9-EGFP/sgRNA-2×PP7和dCas9/sgRNA-2×PP7/GFP-PCP）的成像效果。CRISPR FISHer在端粒上的成像信噪比显著高于另外两种方法。
如果将sgRNA替换成不针对基因组中任何位置的版本，CRISPR FISHer便无法在细胞中实现成像，而sgRNA在活细胞中很容易就会被降解。因此可以推测，dCas9-sgRNA-DNA复合物可以保护sgRNA免受降解，而稳定的dCas9-sgRNA-2×PP7-DNA复合物是募集foldon-GFP-PCP并引发相分离信号放大过程所必需的。

Figure 2. Foldon-GFP-PCP enables robust repetitive genomic loci tracking with enhanced S/B ratio by CRISPR FISHer

 

3. CRISPR FISHer只需一种sgRNA即可实现内源非重复序列以及外源DNA序列的可视化 

人基因组中约65%的序列是非重复序列，几乎所有蛋白编码序列都是非重复的。研究小组接下来测试了CRISPR FISHer在活细胞中给非重复基因组位点成像的能力。研究人员将针对PPP1R2基因的sgRNA（sgPPP1R2.1-2×PP7）、dCas9同foldon-GFP-PCP或GFP-PCP共转染，给PPP1R2基因成像。在共转染foldon-GFP-PCP的细胞中，研究人员观察到了2~4个高亮度的荧光位点，而在共转染GFP-PCP的细胞中没有观察到显著的荧光。在没有共转染dCas9的细胞和共转染了非特异性sgRNA的细胞中，foldon-GFP-PCP倾向于在细胞核内弥散分布，偶尔可见因非特异性结合引起的部分聚集。

为了进一步验证CRISPR FISHer的特异性，研究小组又进行了一系列实验，使用不同的荧光标记在同一个细胞中标记非重复位点和重复序列，均得到了理想的荧光点位富集图像。此外，使用针对HBV的sgRNA，研究小组成功在Hep3B细胞中标记出了HBV整合入宿主基因组的序列。

 

Figure 3. CRISPR FISHer achieves the visualization of the endogenous nonrepetitive genomic region
 
 

Figure 4. CRISPR FISHer allows for visualization of the endogenous nonrepetitive genomic region and exogenous HBV diagnosis in live cells

 

4. CRISPR FISHer可以追踪活细胞内双链断裂引发的染色体分离，以及后续的染色质内、染色质间重连接 

CRISPR-Cas9现在已经广泛应用于生命科学领域，是一种能制造双链断裂的核酸酶。在人体内，双链断裂主要通过非同源末端连接（NHEJ）过程修复。研究小组尝试通过CRISPR FISHer在单个活细胞中标记染色体上的双链断裂点的两端。
首先，研究小组在表达dCas9的U2OS细胞中使用CRISPR FISHer/foldon-GFP-PCP标记了PPP1R2，使用CRISPR-Sirius/stdMCP-tdTomato标记了Chr3Rep（都在3号染色体上）。16小时后，通过Cas9在PPP1R2和Chr3Rep之间制造双链断裂点（DSB）。在导入Cas9之后4小时，研究小组观察到了3对PPP1R2和Chr3Rep的融合及分离事件，这些事件表明，CRISPR切割目标位点后发生了NHEJ过程。此外，研究人员还观察到其中的一对GFP-tdTomato荧光对在Cas9切割后间距缩短，提示DNA损伤发生后发生了染色质构象变化。GFP-tdTomato荧光对在DSB形成后半小时内会维持共定位，之后会逐渐分开（最大距离约1μm），而后会再次出现共定位，过程大约半小时。荧光对之间的分离距离同NHEJ中观察到的基本一致。
接下来研究小组标记了PPP1R2、Chr3Rep和Chr13Rep（分别对应的荧光基团是GFP、tdTomato和Halo），并同时在3号和13号染色体上诱导DSB形成。研究小组观察到了GFP-tdTomato荧光对分离超过7μm，并形成了GFP-Halo荧光对的情况，说明DSB形成的小断裂片段由于移动距离过远导致染色体内NHEJ无法进行，最终发生了跨染色体的NHEJ。在一个细胞中，研究人员同时观察到了染色体内NHEJ和染色质间NHEJ，说明片段之间的距离可能决定了NHEJ具体的修复方式。

Figure 5. Simultaneous imaging of multiple CRISPR target loci tracks real-time dynamics of DNA DSB-induced chromosomal dissociation and subsequent intra- and interchromosomal rejoining in live cells

 

5. CRISPR FISHer能在活细胞中追踪染色质外环状DNA的动态变化 

除了基因组DNA以外，细胞内还可以有其他类型的DNA，比如染色质外DNA（ecDNA）。ecDNA通常比较长（50kb~5Mb），可以通过FISH直接成像，但相对更小的eccDNA成像就不那么容易了。

为了验证CRISPR FISHer标记eccDNA的能力，研究小组从HepG2细胞中分离出含有BEND3、GABRR1或PRKCB的eccDNA，经多种方法验证序列后，以eccDNA的成环接点为靶设计了相应的sgRNA-2×PP7。随后，研究人员尝试使用CRISPR FISHer标记HepG2细胞中相应的eccDNA，观察到了荧光聚集。

之后，研究小组尝试记录单个eccDNA和3号染色体上PPP1R2位点标记的空间变化情况，发现eccDNA上的标记随时间流逝有相对大幅度的位移，而将同样的eccDNA线性化之后其移动能力比环状的差。eccDNA的这种特性表明，eccDNA可能是传递某些信号的信使，这种信号传递过程依赖eccDNA的环状结构。

 

Figure 6. CRISPR FISHer detection and real-time visualization of native extrachromosomal eccDNAs and invading AAV DNA in live cells

 

6. CRISPR FISHer能在活细胞中跟踪腺相关病毒基因组DNA 

最后，研究小组尝试用CRISPR FISHer给入侵宿主的DNA成像。研究小组选择了腺相关病毒（AAV），首先AAV是人源细胞基因编辑常用的载体、没有致病性，其次它的基因组是双链DNA，可以被CRISPR FISHer标记。研究人员先在U2OS细胞中转染了整套针对AAV基因组中TBG位点的CRISPR FISHer系统，然后用AAV感染细胞。转染整套CRISPR FISHer系统12小时之后，研究人员在细胞中观察到均匀的荧光分布。在接受AAV感染且转染了表达针对TBG的sgRNA的质粒的细胞中，可以观察到荧光位点富集，这些荧光位点在细胞中能高速移动，但移动范围有限，说明CRISPR FISHer可以在活细胞中标记AAV来源的DNA，这些AAV来源的DNA被局限在一小块区域内，可能有利于其基因组转录。

 

 

研究结论

 
 

该研究主要介绍了一种在活细胞中标记非重复基因组序列的体系CRIPSR FISHer，该体系通过改造荧光蛋白，添加三聚体基序，通过相分离过程放大荧光信号，提高信噪比。CRISPR FISHer的高信噪比使得该方法有着很高的灵敏度，同时又不需要额外的设备投入。此外，该体系可以用于双链断裂点两侧序列、eccDNA、侵入宿主的病毒DNA甚至是整合进宿主基因组的病毒基因组DNA的标记以及示踪，适用范围宽广，配合其他的RNA和蛋白示踪工具，还可能实现针对基因组的四维分析。

 

(点击阅读原文获取文献)
 
 

参考文献

 

  1. Lyu, XY., Deng, Y., Huang, XY. et al. CRISPR FISHer enables high-sensitivity imaging of nonrepetitive DNA in living cells through phase separation-mediated signal amplification. Cell Res (2022)

     


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