项目文章 | EST12调节Myc表达，通过免疫相关信号通路增强抗结合杆菌的炎症反应

2022年8月Frontiers in Immunology发表了题为EST12 regulates Myc expression and enhances anti-mycobacterial inflammatory response via RACK1-JNK-AP1-Myc immune pathway的研究文章。该研究结合了ChIP-qPCR、CUT&Tag等多种实验方法，发现EST12通过RACK1-JNK-AP1-Myc免疫通路调控Myc表达，增强抗真菌炎症反应。文章的发现为结核分枝杆菌通过Myc诱导免疫提供了新的见解。
工作由武汉大学医学部基础医学院免疫学系团队完成，第一作者吴剑。我司提供了本研究中CUT&Tag相关实验和数据分析服务。

 

研究背景

 

 

结核病是一种容易迁延成慢性感染的呼吸道传染病，药物治疗需要持续较长时间，并且由于耐药结核菌株的出现，药物治疗的效果不一定理想。目前仅有的结核病疫苗是卡介苗，但卡介苗对成年人的保护作用有限。有效疫苗的缺乏、广泛耐药结核（XDR-TB）的出现以及目前主流治疗药物的副作用，使得人们迫切需要了解分枝杆菌免疫反应的精确调控机制。
巨噬细胞是结核分枝杆菌的初始宿主细胞。巨噬细胞主要通过分泌促炎细胞因子杀灭胞内的结核分支杆菌，同时还能呈递抗原给T细胞。促炎性质的M1巨噬细胞有助于对抗结核分枝杆菌感染，而M2型巨噬细胞则有利于其生存。
c-Myc（Myc）是一种转录因子，可调节细胞生长、分化、导致基因组不稳定、凋亡等。Myc还参与到结核病的生理过程中，与调节抗分枝杆菌的炎症反应有关，但是确切机制不明确。
EST12是结核分支杆菌的一种分泌蛋白，能结合活化蛋白激酶C受体并激活一系列免疫相关通路。本研究则发现，EST12可以激活RACK1-JNK-AP1-Myc通路，促进抗感染的炎症反应。

 

 

方法与结果

 

1. EST12诱导早期Myc表达 

研究人员通过RT-qPCR和Western blot，发现在培养的小鼠巨噬细胞株中，EST12显著增加了促炎细胞因子基因（如IL-6和TNF-a）的表达，同时还诱导了四种癌基因RB1、Myc、KRAS和PTEN的表达，Myc最为显著。EST12上调了Myc的感染早期转录，并短暂激活Myc蛋白表达。

 

Figure 1.  Mycobacterial EST12 induces early Myc expression in macrophages during M.tb infection

 

2. EST12通过JNK-AP1-Myc信号通路诱导Myc的表达和磷酸化 

Western blot结果表明EST12激活了感染早期胞质内JNK、核内AP1和cFos的磷酸化，以及Myc的磷酸化，但是不影响Myc的表达。EST12诱导p-JNK和Myc在野生型巨噬细胞中的表达，而在RACK1缺失巨噬细胞中不能，表明EST12诱导p-JNK和Myc表达的过程依赖RACK1。这些数据表明EST12和RACK1的相互作用通过JNK-AP1-Myc信号通路诱导了Myc的表达和磷酸化。
 

Figure 2.  EST12 induces the expression and phosphorylation of Myc through JNK-AP1-Myc signaling pathway

 

3. EST12在感染后期诱导促炎细胞因子iNOS/NO的产生 

Western blot分析表明，在感染后期（EST12刺激12-24小时后）iNOS表达增加，但是Myc抑制剂处理能阻断EST12诱导的iNOS表达。ELISA分析表明，EST12显著诱导IL-6、TNF-α和NO的表达，这些效应可以被Myc抑制剂处理扭转。EST12刺激不会影响分泌型IL-10和TGF-β的表达。

 

Figure 3. EST12-induced Myc-mediated classical M1 cytokines expression and activation eliminates intracellular M.tb

 

4. EST12促进Myc与IL-6和TNF-α启动子结合，进而诱导IL-6和TNF-α表达 

 

CUT&Tag结果显示，EST12特异性地在IL-6、TNF-α和iNOS的启动子区域诱导差异结合峰。ChIP-qPCR检测证实了Myc的关键结合位点。接下来，进一步进行EMSA，使用相应的DNA探针确定EST12诱导的Myc是否结合IL-6和TNF-α启动子，发现EST12预处理过的核提取物强烈结合带有Myc结合motif的核酸探针，结合过程可以被带有Myc结合motif的干扰探针竞争性打断，但不能被带有突变过的Myc结合motif的探针打断。这些结果表明，EST12诱导Myc与IL-6和TNF-α启动子结合，从而增加了这些细胞因子的表达。

 

Figure 4. EST12 promotes Myc to bind to the promoters of IL-6 and TNF-a, and then induces IL-6 and TNF-a expression

 

5. EST12通过RACK1-JNK信号通路诱导巨噬细胞的M1极化  

EST12在感染早期诱导Myc的表达，但在感染后期减少Arg1和Myc表达，增加iNOS、IL-6和TNF-β表达。Western blot显示，与野生型相比，RACK1缺失在感染后期显著降低EST12诱导iNOS、NO、IL-6和TNF-α表达的能力。同时，实验发现EST12诱导iNOS、NO、IL-6和TNF-α表达的能力依赖JNK，JNK抑制剂显著抑制了EST12诱导的效应。
 

Figure 5. EST12 induces classical M1 activation relying on RACK1-JNK signaling pathway

 

 

6. EST12诱导RACK1-JNK-AP1-Myc免疫通路 

EST12是否通过结合TLR2/4调节巨噬细胞的Myc表达？答案是否定的——M0型巨噬细胞和M2型巨噬细胞都表达Myc，M1型不表达。野生型和TLR2/4敲除的M0型巨噬细胞受到EST12刺激后Myc的表达没有显著差异。但是，如果用细胞松弛素D抑制胞吞，EST12诱导Myc表达的能力就会显著下降。
综上所述，研究结果表明，结核分枝杆菌分泌效应蛋白EST12通过胞吞进入巨噬细胞，调控Myc蛋白的早期表达，EST12通过RACK1-JNK-AP1-Myc免疫通路调控Myc表达并促进巨噬细胞向M1型分化，增强抗分枝杆菌炎症反应。

 

Figure 6. EST12 induces Myc expression and activation through endocytosis but not through binding of TLR2/4 of macrophage

 

 

 

 

 

 

研究结论

 
 

 

该研究表明，结核分枝杆菌分泌的EST12蛋白可诱导Myc蛋白的早期表达和晚期降解。EST12蛋白激活JNK-AP1-Myc信号通路，促进Myc与IL-6、TNF-α和iNOS启动子的结合，进而诱导促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）、iNOS和NO的表达，以RACK1依赖的方式增加分枝杆菌清除率，而Myc和JNK抑制剂都会削弱这些作用。

 

(点击阅读原文获取文献)
 
 
 
 

参考文献

 

 

  1. Zonghai C, Tao L, Pengjiao M, Liang G, Rongchuan Z, Xinyan W, et al.Mycobacterium tuberculosis Esat6 modulates host innate immunity by downregulating mir-222-3p target pten. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis (2022) 1868(1):166292.

     

  2. Global tuberculosis report 2021. Geneva: World Health Organization (2021).

     

  3. Wu Y, Tian M, Zhang Y, Peng H, Lei Q, Yuan X, et al. Deletion of Bcg_2432c from the bacillus calmette-guerin vaccine enhances autophagy-mediated immunity against tuberculosis. Allergy (2022) 77(2):619–32.

     

 

 

 

 

 

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