单细胞RNA测序技术进展及挑战之必读综述

单细胞分离是获取单个细胞转录组信息的首要步骤，文中介绍了多种单细胞分离技术，为提高单细胞分离的效率和纯度，可采用以下方法：

1. 荧光激活细胞分选技术（FACS）：是分离高度纯化单细胞的常用策略，尤其适用于目标细胞标记物表达水平低的情况。通过荧光单克隆抗体标记细胞，识别特定表面标志物来分选不同细胞群 ，也可对未染色群体进行负选，利用静电偏转系统对目标细胞施加电荷，通过磁性分离细胞。但该技术需要较大起始体积，从低数量（<10,000）输入样本中分离细胞存在困难，且需要针对目标蛋白的单克隆抗体。

2. 微流控技术

常规微流控技术：因样本消耗低、分析成本低和能精确控制流体而受青睐，所需纳升级体积可大幅降低外部污染风险。如Fluidigm C1平台可在单个芯片上并行处理多达800个细胞的自动化裂解、RNA提取和cDNA合成，相比基于试管的技术，假阳性更低、偏差更小。然而，其存在捕获细胞数量要求多（>1000）和分析细胞大小均一性受限的缺点。

基于微滴的微流控技术：能使水滴在连续油相中单分散，与标准微流控腔室相比，所需体积更小，可低成本操控和筛选数千到数百万个细胞。10× Genomics的Chromium系统可对单细胞RNA的3'端进行高通量分析，捕获效率高，有助于分析异质生物空间中的稀有细胞类型，但处理临床样本时需谨慎维持细胞原有特性。 

3. 其他技术：CellSearch系统利用与抗体偶联的磁体，可对患者血液样本中上皮来源（CD45−和EpCAM+）的稀有循环肿瘤细胞（CTCs）进行计数和分离，在临床检测特定细胞方面具有应用价值。 

图1 单细胞分离与文库制备。

a. 限制稀释法利用稀释细胞的统计分布来分离单个细胞。

b. 显微操作是指使用显微镜引导的毛细管移液器收集单个细胞。

c. 荧光激活细胞分选技术（FACS）通过用荧光标记蛋白标记细胞来分离高度纯化的单个细胞。

d. 激光捕获显微切割技术（LCM）利用计算机辅助的激光系统从固体样本中分离细胞。

e. 用于单细胞分离的微流控技术所需样本体积为纳升级。图中展示了一种基于微滴的自制微流控技术示例（如Drop-Seq）。

f. CellSearch系统通过使用与循环肿瘤细胞（CTC）结合抗体偶联的磁体，对患者血液样本中的CTC进行计数。

g. 基于微滴的文库构建示意图。单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库通常通过细胞裂解、使用带有独特条形码的磁珠将RNA逆转录为第一链cDNA、第二链合成以及cDNA扩增等步骤来构建 。 

单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库制备是深入研究转录组的关键环节，其流程包括多个核心步骤，且在技术发展中不断改进以适应研究需求，具体如下：

1. 基本流程与挑战

制备步骤：常规流程依次为细胞裂解、逆转录为第一链cDNA、第二链合成和cDNA扩增。细胞在低渗缓冲液裂解后，通过聚（dT）引物筛选捕获mRNA。

效率问题：受泊松采样影响，仅有10 - 20%转录本在此阶段被逆转录，低mRNA捕获效率成为现有方案的重要难题，急需高效细胞裂解策略。

2. 关键环节技术选择

逆转录酶：第一链cDNA合成常采用改造后的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，其低RNase H活性和高热稳定性有助于反应进行。

第二链合成：可通过聚（A）加尾或模板转换机制合成。模板转换机制能保证均匀覆盖且不丢失链特异性，较聚（A）加尾更具优势。

cDNA扩增：可选择常规PCR或体外转录。体外转录虽能线性扩增模板，但因需额外逆转录步骤，耗时久且可能造成3'端覆盖偏差。

 测序平台：Illumina平台应用广泛，如HiSeq4000、NextSeq500等，其中MiSeq测序仪周转快，一天约能产生3000万对末端读长。

3. 成本控制与技术改进

末端聚焦策略：为降低测序成本，以往研究聚焦转录本的5'或3'端进行分析。

UMIs和条形码技术：研究人员在逆转录步骤引入UMIs或条形码。其能有效去除PCR偏差，将读长准确对应到原始细胞，提高准确性和可重复性。但现有基于UMI标签的方法只能对转录本的5'或3'端测序，在等位基因特异性表达和异构体分析方面存在局限 。 见下表。

表 1 对比了 Smart-seq、MARS-seq、CEL-seq 和 Drop-seq 四种 scRNA-seq 文库制备方法，结论为不同方法在转录本检测区域、目标读深度、UMI 使用、扩增方式及技术特点等方面各有优劣，适用于不同研究需求 。

转录本检测区域：Smart-seq 可检测全长转录本，适合研究可变剪接和等位基因特异性表达；MARS-seq、CEL-seq 和 Drop-seq 聚焦 3' 端，利于大规模细胞转录组分析，降低成本和工作量。

UMI 使用：MARS-seq、CEL-seq 和 Drop-seq 使用 UMI，可减少 PCR 偏差，提高定量准确性；Smart-seq 无 UMI，在这方面存在不足。

扩增方式：Smart-seq 和 Drop-seq 采用 PCR 扩增，可快速获得大量 cDNA，但可能引入偏差；MARS-seq 和 CEL-seq 运用体外转录（MT）线性扩增，能保留转录本原始丰度，但过程复杂、耗时。

技术特点：Smart-seq 用于异构体分析；MARS-seq 支持 FACS 分选和多重条形码，可同时分析多种细胞类型；CEL-seq 通过线性扩增，适合分析低丰度转录本；Drop-seq 基于乳液技术，成本低、通量高，适合大规模单细胞研究。

1.数据预处理：获取 scRNA-seq 数据后，先用 FastQC 检查质量，去除低质量碱基和接头序列。随后进行读段比对，使用 BWA、STAR 等工具，UMIs 序列需提前修剪。RNA-seQC 可提供比对后统计信息，内参可用于评估文库质量。比对后，依据转录本注释将读段分配，高质量的外显子比对读段用于生成基因表达矩阵。

2.数据归一化：scRNA-seq 数据零值过多，需归一化消除细胞特异性偏差。常用方法有 RPKM、FPKM 和 TPM，通过标准化细胞间的表达值实现归一化，但这些方法在检测差异表达基因时存在不足，可能误判。为解决这些问题，TMM 和 DESeq 等样本间归一化方法被开发出来，但它们在处理大量零计数时效果不佳。基于合并表达值的归一化方法可避免随机零计数问题。此外，归一化方法会影响高变基因的选择，进而影响数据异质性分析，样本内与样本间归一化方法的结合仍有待研究。

3.混杂因素估计：scRNA-seq 数据受生物变量和技术噪声等多种因素影响，起始材料少会放大技术噪声影响，虽可用内参应对，但部分基于微滴的应用难以使用内参。scRNA-seq 实验通常对单一条件下的细胞测序，批效应明显，重复分析可评估批效应，但成本高。此外，生物变量也会影响基因表达。scLVM 方法可去除潜在变量导致的变异，复杂统计模型也可用于处理已知和未知变量 。

图 2 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析流程示意图

1. 降维处理：人体细胞类型多样，为避免 “维度诅咒”，在单细胞RNA测序实验中，读计数归一化后常进行降维。主成分分析（PCA）是常用的无监督线性降维法，能将细胞投影到二维空间，便于可视化和分析。此外，t - 分布随机邻域嵌入（tSNE）、多维缩放、局部线性嵌入（LLE）和等距映射等非线性降维方法也可使用。不过，降维可能导致重要生物信息丢失。

2. 聚类分析与低质量细胞检测：聚类是检测低质量细胞的有效方法，可通过识别线粒体（mt）基因富集的簇来实现。因为细胞膜破裂时，mtDNA基因会上调，细胞质RNA会丢失。完成划分后，需确定不同簇间差异表达的标记基因。对于单细胞数据中的噪声，负二项分布模型比简单的泊松模型拟合效果更好，此外还可采用误差模型来处理技术噪声。单细胞差异表达分析平台采用混合概率模型，能更好地分析单细胞数据，但细胞分布的异质性可能导致双峰分布 。 

推断调控网络对于理解细胞功能和机制至关重要，在单细胞 RNA 测序分析中推断调控网络的相关方法和面临的挑战如下：

1.基于基因共表达推断调控网络：基因共表达网络可用于推断转录因子（TF）与靶基因间的调控关系。其构建基于基因表达数据，假设共表达基因可能存在调控联系。然而，这种方法存在局限性，共表达关系可能由间接调控或其他生物学过程导致，并非直接的 TF - 靶基因调控，所以难以确定真正的调控关系。

2.整合多组学数据推断调控网络：为克服基因共表达网络的局限，可整合转录组、染色质可及性和蛋白质组等多组学数据。通过综合分析不同组学数据，利用相关算法和工具，能更准确地推断 TF - 靶基因相互作用。例如，结合染色质可及性数据，可判断 TF 是否能结合到靶基因启动子区域，从而更有力地支持调控关系的推断。但整合多组学数据面临诸多挑战，不同组学数据在数据类型、规模和分辨率等方面存在差异，需要有效的数据预处理和整合策略 。

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）在多个领域展现出重要价值，其潜在应用广泛且未来发展前景光明，主要体现在以下方面：

1.基础生物学研究：scRNA-seq 能够在单细胞水平解析基因表达调控，助力研究细胞分化、发育轨迹及细胞间相互作用，深入探索生命发育和疾病发生的分子机制，为理解基础生物学过程提供关键信息。

2.疾病诊断与治疗：在疾病研究中，scRNA-seq 可用于识别疾病相关的细胞亚群和生物标志物，为疾病诊断提供新的视角和靶点。在肿瘤研究里，有助于了解肿瘤细胞的异质性，从而为个性化治疗方案的制定提供依据。此外，还能监测治疗过程中细胞的变化，评估治疗效果，推动精准医疗的发展。

3.药物研发：scRNA-seq 可以对药物处理后的细胞进行分析，明确药物作用的细胞靶点和作用机制，筛选出潜在的药物靶点，加速药物研发进程。通过观察细胞对药物的反应，还能评估药物的疗效和毒性，有助于优化药物设计，提高研发成功率 。

4.技术发展方向：未来，scRNA-seq 技术将朝着提高通量、降低成本以及增强分辨率的方向发展。同时，开发新的数据分析方法以应对数据复杂性，整合多组学数据全面理解细胞状态也至关重要。此外，拓展在空间转录组学的应用，探究细胞在组织中的空间分布和相互作用，将为生命科学研究提供更丰富的信息 。