环状DNA的过去和未来
相信很多读者都跟小编一样，当第一次看到2019年11月21日发表在Nature上的那篇首次解析了ecDNA的结构与功能的长文时（详解 文献解读 | eccDNA-促进开放态染色质和癌基因的表达），脑海里闪现了大大的“Amazing”，像一位远游已久的朋友突然出现，熟悉又陌生的感觉（文献解读 | ecDNA与癌基因及比邻增强子的环化共扩增密不可分）。
ecDNA是什么？ecDNA的中文名字叫做染色体外DNA（Extrachromosomal DNA）。其实，这并不是一个新鲜的词汇，染色体物质在常染色体组之外的存在已经被认识很久了，它们与癌基因的扩增及癌症发生发展的关系也早已被研究者发现。但是，ecDNA它也并不像其他分子如非编码RNA那样被大众广知。
事实上在前述提及的Nature文章发表之前，今年年初来自美国加州大学圣地亚哥分校的Paul S. Mischel教授（Nature研究论文的Last author）、Vineet Bafna教授以及杰克逊基因组医学实验室的Roel G. W. Verhaak教授，在Nature Reviews Cancer上发表观点性论文“Extra chromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution”，详细介绍了癌基因在ecDNA上扩增的重新发现的过程，强调ecDNA在肿瘤发病机制和加速癌症进化中的重要性。下面请跟着编者一起走进ecDNA的过去和未来，了解这个神奇的分子。
ecDNA的发现史
在真核细胞中，在染色体外的DNA中发现基因的存在并不新鲜，迄今为止，在研究的许多真核生物物种中都能发现染色体外的DNA颗粒，包括酵母、果蝇、线虫、甚至是人。这之中，有部分被称为染色体外环状DNA (eccDNA)，根据生物物理学方法和DNA测序，其被认为是环状的，通常小于1 kb，并且在光学显微镜下是看不见的，包括端粒环、多分散的小DNA元件、microDNA等。这些小的DNA元件缺少完整的基因，并且在正常细胞和肿瘤细胞中都存在，但是仍有研究证实，它们可能可以通过促进端粒的选择性延长或加剧基因组的不稳定性而在肿瘤的发生发展中起重要作用。
与eccDNA几乎同时被发现的，是另外一类染色体外的DNA颗粒，与前者相比，后者主要有以下不同：分子量很大，通常在1-3Mb或者更大；包含1个或多个完整的基因和调节区域；光学显微镜下可见。本文作者用ecDNA来描述这类染色体外的DNA颗粒，包括双微体形式和缺少着丝粒或端粒的形式，这也是本文阐释的重点。
最早关于癌基因可能存在于ecDNA元件的报道可以追溯到20世纪80年代，当时Alt和他的同事使用克隆的方法，在IMR-32神经母细胞瘤细胞系中证明，类似MYCN基因的序列可以定位到均质染色区（Homogeneously staining regions，HSR）和双微体上【1】。随后，ecDNA上癌基因的扩增及其复制机制被陆续破解。所有的这些研究都极具前瞻性，都提示着癌基因在ecDNA上扩增的重要性。但是，正所谓生不逢时，ecDNA的发现大大早于人类基因组计划的完成，当高通量测序盛行的时候，当其被证明在检测体细胞变化方面非常有效之际，该领域的研究重点转向了全基因组的体细胞变异，而不再是染色体外扩增。事实上，那个时候，根据Mitelman的癌症染色体畸变和基因融合数据库，ecDNA被认为是癌症中的一个罕见事件，其在肿瘤中的发生率只有1.4%。
为ecDNA正名——在癌细胞中很重要
直到2014年，Mischel实验室发现胶质母细胞瘤对EGFR抑制剂的耐药性是由ecDNA上的EGFRvIII功能获得性突变的可逆性丢失引起的【2】，人们才重新开始注意ecDNA的功能。研究者们发现，高通量短读长DNA测序方法，虽然可以通过比较肿瘤基因组和生殖细胞基因组之间的序列读取密度来推断肿瘤DNA拷贝数分布，但是它通常是将癌细胞中的扩增基因匹配到它们在正常组织中的对应染色体位点上的，这就很有可能导致ecDNA在测序过程中的大量丢失。因此，科学家们结合全基因组测序、计算机和细胞遗传学图像分析，开发出一种无偏倚的ecDNA检测方法，检测结果发现在天然染色体位点上的癌基因扩增相对较少，但是在癌症中ecDNA的扩增则较为普遍【3】。
随后，越来越多的实验都表明，ecDNA的存在是强大且普遍的，它可以使癌基因在肿瘤细胞中的拷贝数大量增加，而这对于染色体扩增来说是很难实现的。此外，研究还发现，由于ecDNA缺少着丝粒，使得它们在有丝分裂时随机不均匀分配到子代细胞中（图1），因而其扩增使肿瘤能够快速获得并维持瘤内遗传异质性，这也意味着ecDNA在加速肿瘤进化中起着核心作用。
ecDNA的形成及发病机制
目前，ecDNA的形成及发病机制虽然还不是很清楚，但是科学家们建立了一个可能的发展模型：首先，DNA双链断裂、染色体重排或其他可能发生的染色体事件，都可能导致DNA片段环化形成ecDNA；然后，在肿瘤抑制基因失活或缺失的情况下，细胞可以避开对损伤DNA的清除修复反应而开始复制ecDNA元件；紧接着，由于ecDNA缺少着丝粒，使得它们在子代细胞发生不均等分离，这可能会迅速导致肿瘤细胞内ecDNA数量的异质性，使得子代细胞比亲本细胞获得更高的ecDNA拷贝数；最后，致癌基因或其他促增殖因子的存在可能为细胞提供一种选择性优势，这种优势由环境条件决定，而这将增加含有ecDNA的细胞的适应性，进而导致肿瘤内ecDNA和癌基因拷贝数的快速增加。
ecDNA的这个形成发展模型也逐渐引起了大家的共识——包含ecDNA的癌细胞可能更能对不断变化的环境做出快速反应，包括对癌症的治疗，如放化疗。因此本文作者也指出，未来的研究将需要更好地探索由ecDNA驱动的癌症是否更容易逃避治疗及其潜在的分子机制。
ecDNA的影响
显然，基于ecDNA的癌基因的扩增可以通过其独特的遗传机制加速癌细胞的进化，使其能够快速应对不断变化的环境。但是ecDNA的功能是否也与染色体DNA不同呢？本文作者指出，了解ecDNA的形成及其对表观遗传调控、染色质开放性和基因转录的影响是必须解决的基础问题。目前该领域的科学家们正在研发新的方法，以探索ecDNA的染色质结构、转录背景和功能在癌症发病机制中的作用，这将大大提高我们对ecDNA在癌症中致病作用的认识，并促进我们了解染色体或染色体外环境如何影响癌基因对肿瘤发生发展和耐药性的影响。
ecDNA研究工具的开发
我们知道，ecDNA与染色体DNA在位置、拓扑结构和生物学等关键方面都有巨大区别，因此，新的研究工具的开发对于更好地探索ecDNA上癌基因的扩增及其在癌症发病机制中的作用至关重要。
首先是对测序分析工具的优化开发。相比于目前常用的短读长测序，每次只能检测单一断裂点，利用纳米孔或PacBio或光学制图技术衍生而来的长读测序（如5-10kb读数）可能可以获得多个断点信息，从而提供关于ecDNA的频率和结构更确凿的证据。与此同时，作者表示他们正在开发一种工具包，能够更好地从高通量短读DNA测序中分辨ecDNAs，如果实现这一目标，则将使人们更深入地了解肿瘤中ecDNAs的数量、范围以及它们与临床特征的关系。
其次，细胞生物学研究工具的扩展也是必须的，以对ecDNA与染色体DNA相关的复制、转录和修复机制的关键部分的活性进行检测。例如基因编辑技术和细胞成像技术的发展将有助于我们更好地了解ecDNA产生和维持的生物学基础。
综上所述，癌基因可以在ecDNA上扩增的重新发现以及ecDNA在癌症中的作用的新发现，都迫使我们重新考虑当前癌症基因组图谱包含的空间信息，并为现代癌症基因组学提供了令人兴奋的新方向。当人们认识到扩增基因的核内位置和空间结构可能对癌症的发生发展以及最终对其治疗产生重要影响时，关于癌基因扩增的讨论就已经重新开始了，只是这一次，ecDNA不会再缺席。
