• RNA结构在基因表达调控的过程中扮演着重要角色，RNA分子内双链的形成多是因为碱基配对，促使RNA分子形成茎环和假节结构。RNA分子间双链结构的形成，多是由于分子间的碱基配对导致的，例如，miRNA-mRNA，lncRNA-mRNA，mRNA-mRNA，相互配对形成双链。鉴于RNA结构的多样性，相关研究历来都是热点与难点，目前用于研究RNA二级结构和分子间相互作用的高通量测序技术种类很多，比如：icSHAPE、DMS-seq、PARIS、CLASH和hiCLIP等，但是这些实验方法捕获RNA高级结构的效能偏低，由于是体外近端连接，导致假阳性率普遍过高，存在局限性。

     

    全新的RIC-seq技术应运而生（RNA in situ conformation sequencing technology），全景式RNA原位构象测序技术，能够在保持细胞完整的前提下一次性捕获所有直接的RNA-RNA配对，或者由蛋白质介导的间接近距离RNA-RNA互作。根据这些空间相互作用数据，不仅可以重构RNA的高级结构，还可以全景式的鉴定非编码RNA的作用靶标。

    RIC-seq

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  • 分析流程

    对于RIC-seq数据将严格按照公司搭建的Pipeline进行分析，具体分析流程如下：

    1、原始数据（Raw Data），首先利用fastqc软件进行质量评估；

    2、采用Trimmomatic去除adapters，并用自制perl脚本去除OCR重复片段；

    3、3’端poly尾端采用cutadapt进一步修剪；

    4、使用STAR软件将原始数据比对到参考基因组和核糖体基因组；

    5、采用samtools对低质量和次要映射进行过滤；

    6、读取gapped reads和chiastically mapped reads，用于确定RNA结构和RNA-RNA互作。

    7、最后采用IGV和Juicebox 3D可视化进行RNA-RNA互作的结果显示与分析。

    关于RIC-seq的文库构建，主要分两个阶段：

    首先，在in situ 阶段：

    1、对HeLa细胞进行甲醛交联，将细胞内原始状态的RNA-RNA互作在其原位水平进行固定；

    2、利用微球菌核酸酶（MNase）对RNA进行随机切割，并在3’末端的切口处进行磷酸化；

    3、在3’末端切口进行生物素标记（pCp-biotin），随后用FastAP碱性磷酸酶，去除3’末端生物素上的磷酸基团，同时在5’末端切口用T4多核苷酸激酶(PNK)进行磷酸化；

    4、所有的RNA片段在保持原有活性情况下进行近端连接。

     

    最后，在in vitro 阶段：
    抽提片段化的total RNA，富集含有C-biotin标记的RNA片段，构建文库进行测序（长度约260bp）

    文库构建

  • 2020年5月6日，Nature 杂志在线刊发了中国科学院生物物理研究所、河南师范大学和信阳师范学院合作完成的研究成果，该研究开发了能够在细胞原位水平上捕获RNA高级结构及分子间互作位点的RIC-seq新技术，解析了HeLa细胞中mRNA和非编码RNA的构象和组织规律，绘制了全基因组增强子-启动子RNA的调控网络图谱，阐明了增强子RNA激活癌基因MYC 转录的新机制。生物物理所博士生蔡兆奎、副研究员曹唱唱和吉蕾为论文共同一作，薛愿超研究员为通讯作者。

    研究人员利用该技术首次绘制了HeLa细胞内RNA-RNA的原位三维作用图谱，揭示了蛋白质编码mRNA以及非编码RNA的空间组织规律与特征。在应用上率先发现了增强子和启动子非编码RNA之间的相互作用，可用于推断其调控网络，并详细解析了超级增强子lncRNA CCAT1-5L 与RNA结合蛋白hnRNPK、MYC启动子和增强子RNA结合以改变染色质构象，进而调节癌基因MYC 转录的新机制。研究发现RIC-seq技术不仅能检测RNA的高级结构，而且可准确鉴定各类非编码RNA的作用靶标，为后续深入研究非编码RNA所携带的“结构密码”及其功能性提供了全新的实验工具。此外，该技术在病毒RNA的结构和靶标研究方面也有广阔的应用前景。

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  • 细胞样品

    若客户送样为培养中的新鲜细胞，我们会对细胞进行细胞计数和RNA-RNA的交联，具体要求为:

    1、细胞量 >10million/份（制备2~3份）

    2、客户样品、样品的完整信息单

    3、送样前一天通知实验人员，准备时间进行细胞处理

     

    已固定细胞

    若客户自己进行细胞的固定，请务必严格按照销售提供的实验操作步骤进行。具体送样要求为:

    1、细胞量 >10million/份（制备2~3份）

    2、客户样品、样品的完整信息单

     

    动物组织

    1、所送动物组织质量应当>100mg，并且组织新鲜。

    2、建议取材后用生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织等非研究组织。

    3、将样品分割成50 mg左右的小块，样品分割和处理时应尽量在冰上进行，防止样品降解。

    4、为确保实验的顺利，建议样品备份2~3份，以防备部分样品降解重新取材、制备或送样，耽误时间。

    5、客户样品、样品的完整信息单。

     

    植物组织

    1、植物组织质量应当 >5g，并且组织新鲜，

    2、制备成原生质体，数目大于2×10^7个，（制备2~3份）；

    3、按照细胞的方式进行甲醛固定（参见2.2），富集细胞沉淀后送样。

    4、为确保实验的顺利，建议样品备份2~3份，以防备部分样品降解重新取材、制备或送样，耽误时间。

    5、客户样品、样品的完整信息单