• 目前研究发现RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）是调节基因表达的关键因素。RBP功能缺失会导致很多疾病，例如神经病变，自身免疫缺陷和癌症等。为研究RBPs调控RNA的机制，涌现出大量的新技术如RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP），紫外交联免疫沉淀（crosslinking-immunoprecipitation，CLIP）等。

    随着NGS的广泛应用，开发出了多种研究技术，如：RIP-seq、MeRIP-seq、CLIP-seq、iCLIP-seq、eCLIP-seq、hiCLIP-seq等。其中eCLIP-seq（enhanced CLIP-seq）应用广泛，不仅能实现单碱基水平的分辨率，还能以更强大的框架方式在全基因组范围内mapping RBPs信息。在显著降低测序过程所需的扩增次数同时，极大地提高了RBPs文库可读百分比的成功率，并改善了配对input的信噪比。

    eCLIP-seq

  • 获得下机测序数据后，分析流程如下：

    1、Fastqc软件对原始数据进行质量评估；

    2、Cutadapt过滤接头序列与低质量序列；

    3、STAR软件将Clean Data比对到参考基因组；

    4、Picard去除PCR重复序列；

    5、Samtools处理比对结果，构建index；

    6、Clipper鉴定reads富集区域；

    7、对比input样本数据

    8、标准化处理，计算高富集区域；

    9、使用Homer2完成motif分析；

    10、利用R语言实现数据统计、制图、差异分析等。

    分析流程

    eCLIP-seq文库构建，主要分为以下几步：

    1、紫外交联，裂解细胞；

    2、将抗体与磁珠结合；

    3、RNAse处理裂解液；

    4、磁珠捕获RBP-RNA复合体；

    5、转膜；

    6、蛋白酶K处理，纯化RNA；

    7、反转录，纯化cDNA；

    8、连接接头，PCR扩增cDNA；

    9、构建文库，上机测序

    文库构建

  • eCLIP（enhanced CLIP）是CLIP（Ultraviolet cross-linking and immunoprecipitation）的升级版，紫外交联免疫沉淀，是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生共价结合，提高RNA结合蛋白与相应RNA靶标的结合强度，用于研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标的结合模式，揭示其生物学功能。

    技术优势：

    1、准确性高：从活细胞交联开始，反应了体内环境下真实的分子间互作。
    2、特异性强：紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联，能够鉴定靶蛋白和RNA 之间的直接相互作用。
    3、应用范围广：特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。

    应用方向：

    1、验证RNA与靶蛋白的直接相互作用及精确的结合位点；
    2、在全基因组范围内鉴定RNA与RBP的相互作用网络；
    3、lncRNA/circRNA功能机制研究以及miRNA靶标鉴定。
    更多内容 ꅀ

    enhanced CLIP (eCLIP)：

    1、为RBPs在全基因组范围内的maps提供了更加强大，标准化的框架；
    2、显著的降低了测序过程中所需要扩增的次数；
    3、极大地提高了RBPs文库可读百分比的成功率；
    4、改善了发现位点的信噪比。

  • 细胞样品

    确认细胞生长状态良好，对细胞进行准确计数，细胞量 >3x10^7个；

    每个样本准备3~4管，具体细节详询销售

     

     

    动物组织

    应当大于200mg，且组织新鲜；取材后用生理盐水进行漂洗，去除血渍和污物，剔除结缔组织等

     

     

    植物组织

    选取取幼嫩组织，如嫩叶，根尖，幼苗等，需制备成原生质体。建议样品制备 2~3 份。