文献追踪 |6 种空间转录组学(sST)方法大揭秘：空间转录组学的深度对比与评估

基于测序的空间转录组学（sST）技术可在保留组织空间信息的同时进行转录组分析，但目前缺乏对不同平台的全面评估，也未建立统一的评价标准。本研究旨在通过对 6 种 sST 方法的系统比较，为该领域提供基准数据和指导。

• 实验设计

参考组织选择：选取成年小鼠大脑、E12.5 小鼠胚胎和成年小鼠嗅球作为参考组织，因其形态特征明确、基因表达异质，有助于评估方法性能。

H&E 染色图

实验技术：对比基于不同空间索引策略的 6 种 sST 方法，包括微阵列（10X Genomics Visium）、基于珠子的方法（HDST、BMKMANU S1000、Slide-seq）、基于 polony 或纳米球的技术（Stereo-seq、PIXEL-seq）和微流控技术（DBiT-seq）。

数据处理流程：构建标准流程，包括生成空间条形码、保留已知形态区域的读数、下采样以控制测序深度和成本差异，之后进行细胞状态注释和细胞间通讯分析。

• 实验结果

该研究系统性地对 6 种基于测序的空间转录组学（sST）方法展开比较，通过多种实验与分析获取了丰富结果，为深入了解 sST 技术提供了关键依据。下面从分子捕获效率、分子侧向扩散、聚类和细胞注释、标记基因检测这四个方面详细阐述实验结果。

1.分子捕获效率

不同平台捕获效率差异显著：研究人员获取成年小鼠大脑海马体和 E12.5 小鼠胚胎眼睛组织，经手动划定区域，用全部读数或下采样数据评估分子捕获效率。从下采样结果（图 2b、c）可知，各平台测序数据均未达饱和，意味着需更多测序数据提升性能。对比不同平台，Stereo-seq 原始测序深度下，相同区域测序读数多，总计数高；但控制测序深度后，Slide-seq V2 在眼睛和海马体组织中敏感性更高，DBiT-seq 则最低（图 2d、e）。

图 2 不同平台生成数据的敏感性比较

a) 示意图展示从成年小鼠海马体和 E12.5 小鼠眼睛的完整处理样本中提取已知形态区域的过程。各平台的总 UMI 计数随逐步下采样的测序深度变化而变化。

b - c) 数据分别来自小鼠海马体和 E12.5 小鼠眼睛区域，垂直黑色虚线表示用于生成后续下采样数据的读数计数。

d - e) 计算小鼠海马体和 E12.5 小鼠眼睛选定区域使用所有读数和下采样数据的总独特分子标识符（UMI）计数。

f - g) 展示小鼠海马体和 E12.5 小鼠眼睛中，五个 100µm×100µm 区域内标记基因的总 UMI 计数，附带均值和标准差。

h) 比较 Visium（x 轴）和 Stereo-seq（y 轴）检测到的基因的总 UMI 计数，每个黑点代表一个基因，在 Stereo-seq 中表达处于第 90 百分位但在 Visium 中处于第 10 百分位的基因以红色突出显示并标注基因符号。

i) 热图展示 E12.5 小鼠眼睛中，Visium 未捕获但 Stereo-seq 捕获的基因的 log₁₀转换后的表达情况。

标记基因表达差异反映平台特性：在检测特定区域标记基因 RNA 含量时，以海马体 CA3 区的 Prdm8、Prox1 和 Slc17a7，以及 E12.5 小鼠眼睛中的 Vit、Crybb3 和 Aldh1a1 等基因为例，在 100µm×100µm 区域内比较计数总和。结果显示，Slide-seq 在这些标记基因检测中敏感性最高，Visium 在预期表达区域的标记基因计数较少（图 2f、g）。进一步分析发现，Visium 存在基因捕获偏差，如在晶状体相关基因检测中，除 Visium 外，其他平台均能检测到 Crybb3 和 Cryaa 等基因表达，而 Visium 未检测到（图 2h、i），且该偏差并非由预处理流程和基因注释导致。

2.分子侧向扩散

不同组织中各平台扩散情况各异：为评估 mRNA 检测的空间准确性，研究人员采用绘制特定基因强度分布图和量化半高宽（LWHM）两种方法测量分子侧向扩散。在嗅球组织中，选择 Slc17a7 作为标记基因，其在 Mitral 和 Tufted（M/T）细胞及谷氨酸能神经元中特异性表达。从各 sST 数据集的 Slc17a7 表达图（图 3a 左）及 LWHM 测量结果可知，Stereo-seq V1 在嗅球中对 Slc17a7 的侧向扩散明显，而 Slide-seq V1.5 和 PIXEL-seq 控制较好（图 3b - d 左）。

图 3 不同平台生成数据的扩散比较

a) 展示选定的在特定区域高表达的标记基因的表达模式，包括小鼠嗅球中的 Slc17a7（左图）、小鼠大脑中的 Ptgds（中图）和 E12.5 眼睛中的 Pmel（右图），图基于原始计数绘制，黑色框为计算扩散的选定区域。

b) 将上述标记基因在嗅球（沿 50µm 每 10µm 汇总）、大脑（沿 500µm 每 10µm 汇总）和眼睛（沿 300µm 每 10µm 汇总）的表达水平聚合，UMI 计数经跨模态平均、平台归一化后以密度图呈现（曲线下面积设为 1）。

c) 给出各模态内上述标记基因的表达水平，黑色虚线为扩散计算边界。

d) 计算各模态中每个基因的左半峰宽（LWHM）并以箱线图展示，每个点代表一种模态的 LWHM 值，无法计算 LWHM 的模态已去除。

在大脑组织中，选取 Ptgds 作为标记基因，其在血管细胞特定位置表达。分析 Ptgds 的表达图和 LWHM 测量结果发现，Stereo-seq 数据存在严重侧向扩散，Slide-seq V2 和 BMKMANU S1000 控制相对较好（图 3a - d 中）。对 Stereo-seq 下采样数据的扩散分析表明，下采样无法解决其侧向扩散问题。在眼组织中，以 Pmel 为标记基因，其在黑色素细胞中特异性表达。结果显示，Stereo-seq 对 Pmel 的侧向扩散控制最佳，Slide-seq V2 次之（图 3a - d 右），这与在其他两种组织中的结果不同，表明组织类型对扩散过程影响较大。

3.聚类和细胞注释

聚类方法和 sST 平台影响细胞亚群识别：研究人员选择 E12.5 小鼠眼睛进行聚类和细胞注释分析，该组织具有独特结构。使用 Seurat、DR.SC 和 PRECAST 三种聚类方法对不同 sST 平台数据进行处理。从聚类结果来看，Seurat 仅基于转录组谱，DR.SC 和 PRECAST 结合空间信息。Seurat 在检测预期细胞亚群时表现稳定，但不同 sST 平台数据在识别细胞亚群能力上存在差异（图 4a）。其中，Slide-seq V2 和 Stereo-seq 数据能较好分离细胞亚群，实现全面注释；BMKMANU S1000 数据因侧向扩散问题，在识别黑色素细胞时面临挑战；Visium 数据受物理分辨率限制，检测预期细胞亚群存在困难，每个样本在眼区的可用点数较少（约 75 个），导致细胞混合，难以识别复杂细胞亚群。

图 4 下游性能比较

a) 展示各平台表达谱聚类结果，包括已知细胞类型标识、预期细胞状态分布及实际聚类标注，CM、pNR、LV 分别代表角膜间充质、推定神经视网膜、晶状体囊泡。

b) 对各平台下采样的眼睛数据聚类，热图呈现其与全数据聚类注释的对应关系（log10 转换后点数）。

c) Stereo-seq 数据示例，呈现 Aldh1a1 和 Aldh1a3 在 10µm 分辨率下的空间表达谱及表达点数。

d) snRNA-seq 数据中 Aldh1a1 和 Aldh1a3 的表达谱与细胞数。

e) 标记基因检测的细胞状态比较概述，以晶状体和黑色素细胞等为例，展示不同平台基因情况。

f) 不同 sST 方法在两对细胞亚群比较中，随读数变化的标记基因检测数量。

g) Upset 图展示不同 sST 方法在两对细胞亚群比较时标记基因的交集情况。

测序深度影响聚类结果一致性：测序深度影响空间转录组数据总计数，研究人员探究其对聚类结果的影响。对下采样数据聚类结果与全数据聚类结果进行比较，并计算聚类纯度（ECP）和准确性（ECA）的熵值（图 4b）。结果发现，下采样数据能检测到全数据中的大部分细胞亚群，但在评估 ECP 和 ECA 时，发现存在较高不一致性。这是因为部分细胞，如神经元视网膜细胞不同亚群之间，以及晶状体和晶状体囊泡细胞等表达谱相似的细胞，在聚类时出现分组差异。

sST 数据与 snRNA-seq 数据相互补充：在所有 sST 数据集中，Pmel、Crybb3、Atoh7、Enfa5、Aldh1a1 和 Aldh1a3 等基因呈现良好表达模式，这些基因是特定细胞类型的标记基因。snRNA-seq 数据在眼区检测到表达这些基因的细胞数量有限，且主要聚集在 UMAP 图的下角，难以进一步细分亚群（图 4d）。然而，snRNA-seq 数据可作为参考，辅助注释 sST 数据。例如，利用 Seurat 整合两种数据，可改善 Stereo-seq 数据中上皮细胞的注释，以及 BMKMANU S1000 数据中黑色素细胞和上皮细胞的分离。此外，sST 技术易受血液污染影响，Visium 和 BMKMANU S1000 受影响较大，Stereo-seq 与 snRNA-seq 的血液污染水平相近，Slide-seq V2 受污染程度最低。

4.标记基因检测

不同技术在标记基因检测上存在偏差：研究人员利用 Wilcoxon 秩和检验在 Seurat 中寻找聚类间的标记基因，发现不同技术在选择标记基因时存在技术特异性偏差。以 Pax6 基因为例，它是神经谱系的关键调节因子，在视网膜发育中起重要作用。Stereo-seq 数据仅在 pNR3 簇中突出显示 Pax6 表达，而 Slide-seq V2 和 BMKMANU S1000 数据显示其在整个神经视网膜（pNR1 - 4）均有表达，这与现有文献一致，表明技术选择会影响特定细胞类型或簇的顶级标记基因识别。类似地，在神经视网膜祖细胞中的 Hes 基因和 pNR1、pNR2 中的 Sox2 基因表达检测中，也观察到不同技术间的差异。

测序深度影响标记基因检测数量：分析下采样数据的聚类结果发现，减少测序读数仍可保留一般细胞亚群，但部分相似表达谱的亚群难以清晰分离。为进一步研究下采样影响，研究人员比较了下采样数据和全数据集的标记基因检测情况。选择 pNR4 和 pNR1（表达谱相似度较高）、晶状体和黑色素细胞（表达谱相似度较低）两对细胞亚群进行检测（图 4e）。

结果表明，随着读数增加，标记基因数量增多，且测序深度加深时增加更明显（图 4f）。在比较表达谱差异较大的细胞亚群时，Slide-seq V2 在标记基因检测性能上表现更优（图 4f 下）。此外，不同平台在各比较对中既有共同识别的标记基因，也有大量独特的标记基因（图 4g）。

5. sST 方法的结果和特点的总结

本研究对多种sST方法进行系统评估，结果呈现出各方法的独特性能与特点。在捕获效率方面，不同测序深度下表现各异。Stereo-seq在原始测序深度时捕获效率最佳，凭借大量测序 reads 获得较高总计数；而Slide-seq v2在标准化测序深度下更具优势，展现出良好的敏感性。不过，Visium平台存在基因捕获偏差，部分在其他技术中能稳定捕获的标记基因，在Visium数据中却未显示，这一现象值得关注。

空间分辨率受多种因素影响，点大小虽常作为衡量指标，但扩散才是影响实际分辨率的关键。不同技术在不同组织上的扩散情况差异明显。例如，Stereo-seq在小鼠胚胎组织上扩散控制良好，但在小鼠大脑组织中扩散伪影较强；Slide-seq V2等在部分组织上对扩散的控制相对较好。透化时间对分子扩散影响重大，是sST技术发展中需要重点优化的因素。

在下游分析中，不同sST方法在聚类和细胞注释方面表现不同。Slide-seq V2和Stereo-seq数据能较好地分离细胞子集，实现全面注释；BMKMANU S1000受侧向扩散影响，在检测特定细胞类型时存在困难；Visium则因物理分辨率较低，在检测预期细胞子集时面临挑战。此外，测序深度对聚类结果有影响，下采样数据虽能检测出大部分细胞子集，但存在一定程度的不一致性。在标记基因检测上，各平台存在技术特异性偏差，且随着测序 reads 增加，标记基因数量增多。总体而言，sST领域发展迅速，各技术性能不断优化，持续评估和深入研究对推动该领域发展至关重要 。 

图 5 对 sST 方法的结果和特点进行了总结。左图依据性能对 sST 方法进行排序，通过颜色和点大小直观呈现各方法在不同类别中的表现；右图概述了所研究 sST 方法的关键特性，包括从无到有构建方法的难度等，为评估和选择 sST 方法提供参考。

下面的表格详细对比了 Stereo-seq、BMKMANU S1000、10X Genomics Visium 和 DBiT-seq 四种空间转录组学（sST）方法的实验流程、透化时间和文库构建等方面的差异，有以下的结论：

实验流程差异：四种方法在组织固定、染色、成像、透化时间优化及 cDNA 合成与处理等步骤上存在不同。例如，Stereo-seq 无前处理的组织固定和染色步骤，而 BMKMANU S1000 和 10X Genomics Visium 都有组织固定和 HE 染色等流程。

透化时间不同：不同方法在大脑和胚胎组织的透化时间有所不同。如 Stereo-seq 在大脑中透化时间为 12 分钟，胚胎中为 18 分钟；而 BMKMANU S1000 和 10X Genomics Visium 在胚胎中的透化时间均为 6 分钟。

文库构建区别：在空间表达实验的文库构建环节，各方法也存在差异。Stereo-seq 是在 Stereo 芯片上进行冰冻切片，后续有一系列的处理步骤；BMKMANU S1000 在 S1000 基因芯片上操作；10X Genomics Visium 在 Visium 基因表达载玻片上进行；DBiT-seq 的流程则更为独特，包括甲醛固定、与 ADTs 孵育、带有特定条形码的逆转录和连接等步骤。这些差异会影响实验的操作难度、数据质量以及最终的应用效果，为研究人员选择合适的 sST 方法提供了参考依据。

表1

 在生物学研究中，评估空间转录组学方法比scRNA-seq更具挑战。其参考组织设计困难，细胞位置和状态不明且受认知限制，而scRNA-seq获取一致输入较易。同时，不同空间转录组学方法测量单位差异大，如Visium点直径大、Stereo-seq点小，增加了评估复杂性。  为此，本研究构建严谨基准测试体系。选用常用模式生物的稳定细胞类型、有特定标记基因且形态清晰的参考组织，制定切片协议保证数据可比。采用多指标和流程，结合全读数与下采样数据对比6种方法，生成cadasSTre数据集。

结果显示，空间转录组学数据远未饱和，Stereo-seq原始测序深度捕获效率最佳，Slide-seq v2标准化深度最优，Visium存在基因捕获偏差，扩散是影响实际分辨率关键因素且受透化时间影响，不同技术在不同组织扩散表现不同。  本研究虽建立首个系统基准测试方案，但仍有优化空间，如受小鼠眼睛发育认知限制影响胚胎数据构建。生成的数据集可用于比较计算工具，开发通用空间工具还需更多组织和数据。

研究发现空间数据聚类工具性能未必优于单细胞聚类方法，注释空间数据应综合考虑有无单细胞参考分析结果。鉴于空间转录组学发展迅速，持续评估很重要，空间多组学处于初期，社区驱动的基准测试联盟对其发展意义重大。

本研究揭示该领域优势与问题，建立比较标准，为空间多组学技术基准测试奠基。 

 

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