m1A-quant-seq：单碱基分辨率精准定量 RNA 修饰的革命性技术
-
m1A-quant-seq 是一项突破性技术，通过定向进化 HIV-1 逆转录酶获得高性能变体 RT-1306，结合 AlkB 脱甲基酶处理和合成 m¹A 寡核苷酸内标，实现全转录组范围内 m¹A 修饰的单碱基分辨率定位与定量分析；其背景突变率低至 0.25%，可检测低至 8% 的修饰丰度，在 HEK293T 细胞中鉴定出 548 个高置信度 m¹A 位点，覆盖 mRNA、lncRNA 等多类 RNA，兼具单碱基精准性与宽动态范围定量能力，为 RNA 修饰机制研究、疾病标志物发现及药物研发提供了革新工具。
m1A-quant-seq
a b PCR primers NH2 steric RTase IVT RT primer T T111111ITIT5 5' N Cycles T T7 promoter Variant +DFHBI-1T clash read-through 5' N- CH )H H-N 5个 LLLL TTTT5 33mer RNA PCR product R R stop 5 X=mA H X→U X→A/G/C U C d U -AUAGA UAUCUG 0.04 0 m1A15 U15 A15 RT primer Full-length pd. Stop pd. 4 0 40 80 9 15 5X 二 X RT CUGGCA 2 Control Control U15 m1A15 U15 A15 full-length stop 一 GAGUGU- A15 1 m1A15 正 PCR GAGGC5 CUCCG PCR Cycle Number=4 X= =U U15 0 X： 【=A A15 0 40 80 IVT 10 C X=miA m1A15 Time (min)
-
对于获得下机测序数据后，分析流程如下：
1、数据质控：去除测序数据中的低质量序列、接头序列 。
2、序列比对：将质控后的数据与参考基因组比对，确定序列位置 。
3、突变分析：统计 m¹A 位点处的突变情况（如 A→T 突变 ）。
4、校准定量：依据 Spike - in RNA 建立校准曲线，计算 m¹A 修饰比例 。
1.RNA 处理：提取总 RNA，除 DNA、小 RNA ，富集 PolyA ，片段化。
2.加内参：加入 Spike - in RNA。
3.逆转录：用改造逆转录酶引入突变。
4.建库测序：制备文库并测序。
5.分析定量：处理数据，依 Spike - in RNA 校准，算 m¹A 修饰比例。
文库构建
分析流程
-
在生命科学领域，RNA 修饰研究近年来成为焦点，其中 N1 - 甲基腺嘌呤（m¹A）修饰因在基因表达调控、细胞生理过程以及疾病发生发展中发挥关键作用，备受关注。准确检测和定量 m¹A 修饰位点，对深入理解其功能机制极为重要。m¹A - quant - seq 技术应运而生，为该领域研究开启了新的篇章。 例如，发表于《Analytical Chemistry》（影响因子 8.008，2020 年发表，doi: 10.1021/acs.analchem.9b04454 ）的论文 “Quantification and Single - Base Resolution Analysis of N1 - Methyladenosine in mRNA by Ligation - Assisted Differentiation” ，通过连接辅助差异化方法实现了对 mRNA 中 m¹A 的单碱基分辨率定量检测。而发表于《Nature Chemical Biology》（影响因子 12.514，2016 年发表，doi: 10.1038/nchembio.2078 ）的 “Transcriptome - wide mapping reveals reversible and dynamic N (1) - methyladenosine methylome” ，利用 m¹A - IP - seq 等技术在转录组范围绘制了 m¹A 图谱。这些研究都凸显了精确分析 m¹A 修饰的重要性，也为 m¹A - quant - seq 技术的发展奠定了基础。
-
样本类型（不限物种）：
1．Total RNA
2．动物组织或者植物组织
3．细胞样本
注 ：具体送样细节 ，请咨询销售。
咨询微信
