•         RedaC:T-seq以单碱基分辨率革新RNA乙酰化研究，通过NaBH₄特异性还原ac4C为四氢衍生物，在逆转录中精准诱导C>T碱基转换，结合高通量测序与定制化生物信息学流程，实现全转录组范围内ac4C修饰位点的高灵敏度捕捉。 从细胞系到组织样本，技术兼容多类型生物材料，配套NAT10敲除对照策略有效排除假阳性，助力研究者深度解析ac4C修饰的位置依赖性功能，如mRNA翻译调控机制。

     

    ac4c-meRIP-seq

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    RedaC:T-seq 实验流程如下：

    1.RNA 制备：培养 WT 及 NAT10⁻/⁻细胞，提取总 RNA 并经 DNA 酶处理纯化。

    2.核糖体 RNA 去除：用试剂盒杂交、酶解 rRNA，磁珠纯化获得目标 RNA。

    3.NaBH₄处理：特异性还原 ac4C 为四氢 ac4C，中和后乙醇沉淀纯化 RNA。

    4.文库制备：逆转录合成 cDNA，末端修复、接头连接后 PCR 扩增，磁珠纯化构建文库。

    5.质控与测序：Bioanalyzer 检测文库完整性，Sanger 测序验证 C>T 转换效率。

    6.数据分析：修剪适配器、STAR 比对，mpileup2readcounts 筛选位点，R 语言统计分析筛选差异 ac4C 位点。

    文库构建

    分析流程

    1.接头与质量控制：使用 cutadapt 去除测序接头和低质量序列，保留高质量 clean reads；

    2.参考基因组准备：下载目标物种的参考基因组及注释文件，并进行格式化处理；

    3.比对索引构建与比对：采用 STAR 构建参考基因组索引，并将 clean reads 比对至基因组，生成 BAM 文件；

    4.比对结果整理：利用 samtools 对 BAM 文件进行排序、合并和索引，完成比对后处理；

    5.错配统计：通过 samtools mpileup 和自定义 mpileup2readcounts 脚本，统计每个位点的碱基错配情况；

    6.深度过滤：使用 awk 命令筛选测序深度大于设定阈值（如 ≥ 10）的高置信位点；

    7.数据预处理：使用 RedaC:T-seq 提供的 Perl 脚本解析统计文件，提取 C-to-T 转化相关信息；

    8.错配率计算与坐标映射：在 R 语言中计算错配率，并将基因组坐标映射至转录本水平；

    9.统计检验：采用 Fisher’s Exact Test 对比实验组（NaBH4处理）与对照组（Input，未处理）在各位点的 C-to-T 错配率，评估是否存在显著差异；

    10.候选位点筛选与可视化：依据设定的显著性阈值筛选高可信 ac4C 候选位点，并进行可视化展示。

    11.Motif挖掘，对修饰位点进行Homer denovo的motif挖掘。

  •         RNA 修饰在基因表达调控中扮演着关键角色，其中 N4 - 乙酰胞嘧啶（ac4C）修饰作为一类新型 RNA 修饰，近年来成为表观转录组学研究的热点。ac4C 修饰由 N - 乙酰转移酶 10（NAT10）催化产生，广泛分布于人类转录组中，对 mRNA 的稳定性、翻译等过程具有重要影响。 为了精准检测 ac4C 修饰位点，科研人员开发了一系列技术，今天要介绍的 RedaC:T - seq 就是其中一种能够实现 ac4C RNA 乙酰化修饰单碱基分辨检测的重要方法。这一技术相关内容发表于《Protocol for base resolution mapping of ac4C using RedaC:T - seq》，该文献于 2022 年 12 月 16 日发表在《STAR Protocols》期刊上，影响因子为 [具体影响因子数值，需根据最新数据更新]，doi 号为 10.1016/j.xpro.2022.101858 。

           N4 - 乙酰胞嘧啶（ac4C）是由 NAT10 催化的 mRNA 修饰，影响翻译效率。本 protocol 介绍 RedaC:T-seq 技术，通过 NaBH₄还原 ac4C 为四氢 ac4C，使其在反转录时与 A 配对致测序中 C→T 转换，结合 Illumina 测序和生物信息学分析，实现 ac4C 单碱基分辨率定位。该方法可用于多种细胞类型，为研究 ac4C 修饰功能提供技术支撑。

  • 样本类型（不限物种）：

    1．Total RNA

    2．动物组织或者植物组织

    3．细胞样本

    注 ：具体送样细节 ，请咨询销售。

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